一種檢測橡膠植物中的小橡膠粒子蛋白含量的方法以及使用該方法篩選橡膠植物品系的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種使用表面等離子共振技術檢測橡膠植物乳液中的小橡膠粒子蛋 白的方法W及利用該方法進行橡膠植物品系篩選的技術。同時，本發明還提供一種基于表 面等離子共振技術檢測橡膠植物乳液中的小橡膠粒子蛋白的傳感器巧片。
【背景技術】
[0002] 世界上約有2000種不同的植物可生產類似天然橡膠的聚合物，人們已從其中500 種橡膠植物中得到了不同種類的橡膠。不同的橡膠植物中含膠量有很大差異。天然橡 膠在橡膠粒子上合成，很多蛋白、酶等與橡膠的合成有關。其中，小橡膠粒子蛋白（small rubberparticleprotein(簡稱為SRP巧）是一種關鍵蛋白，與橡膠的合成緊密相關。橡 膠植物的含膠量取決于植物中的小橡膠粒子蛋白含量（參見化，S.K. ;Kang，H. ;Shin，D. H. ；Yang,J. ；Chow,K.S. ；Yeang,H.Y. ；Wagner,B. ；Breiteneder,H. ；Han,K.H.J.Biol. 化em. 1999, 274, 17132 - 17138.)。通過檢測一種橡膠植物中的SRPP含量，可W推測該橡膠 植物的產膠量。
[0003] 另外，目前市場上的天然橡膠來自從橡膠樹上采集的天然橡膠乳液。但傳統的天 然橡膠產量低。橡膠樹生長在亞熱帶、熱帶地區。中國亞熱帶地區面積較小，自產天然橡膠 遠遠不能滿足日益增長需求量。再者，天然橡膠主要被東南亞國家所壟斷。在復雜的國際 形勢下，天然橡膠依賴于從東南亞國家進口嚴重影響了我國的橡膠安全。
[0004] 橡膠草是多年生草本植物，包括菊科蒲公英等。橡膠草含有天然橡膠乳液，能制造 天然橡膠。我國面積廣大，從溫帶到亞熱帶種都可種植橡膠草。因此，中國研究機構已開始 研究從橡膠草上采集天然膠乳，W制備天然橡膠。
[0005] 但是，橡膠草中含膠量普遍較低。需要從野生的橡膠草中篩選出天然乳膠含量高 的橡膠草品系和植株，進行人工培育，W大規模推廣種植。天然乳膠含量取決于SRPP的含 量。通過檢測一種品系的橡膠草中的SRPP含量便可知其產膠潛力，便可篩選出高產膠量的 橡膠草品系。因此，急需一種低成本、可定量、靈敏、快速、能夠在現場進行檢測的橡膠草品 中的SRPP的檢測方法。
[0006] 但是，在本發明之前，尚沒有公開一種能夠檢測SRPP含量的技術手段，特別是沒 有人報道過一種同時滿足低成本、特異性、可定量、快速、靈敏、可現場進行檢測等要求的檢 測植物乳液中的SRPP的技術手段。
[0007]表面等離子共振技術（SurfacePlasmonResonancetechnology,簡稱為SPR)發 展于20世紀90年代，是基于檢測生物傳感巧片上配位體（ligand)與分析物相互作用的先 進技術，可快捷簡便地檢測蛋白質分子間及藥物與蛋白質、抗原與抗體、核酸與核酸等生物 分子間的相互作用，在醫療檢測、食品檢測、環境監測、法醫鑒定等領域具有廣泛應用前景。
[0008] 對SPR技術的原理說明如下：當光線在棱鏡與金膜表面上發生全反射現象時，一 部分光會被光疏介質吸收，從而在金屬膜中產生消逝波。而若把金屬的價電子看成在均勻 正電荷之下不斷運動的電子氣體，那么它實際上也是一種等離子體。當金屬被電磁干擾時， 金屬中將產生不均勻分布的電子密度。此時消逝波與金膜表面的等離子波將發生共振，若 檢測反射光，將發現較大程度的減弱現象。因能量已從光子轉移到表面等離子，表面等離子 波吸收了入射光的大部分能量，該樣就造成反射光的能量加劇減少。因此，在反射光強的響 應曲線可W看到一個最小的尖峰，該時所對應的入射光波長稱為共振波長，對應的入射角 稱為共振角，即SH?角。SH?角因金表面折射率變化而變化，又因折射率的變化與金表面結 合的分子質量是成正比關系。通過該種對應關系便可實現對目標物質的快速檢測。
[0009] 本發明的基于SPR的檢測方法和免疫傳感器解決了上述技術難題，首次為橡膠草 品系的篩選和進一步培育提供科學依據，無論從經濟意義還是我國的橡膠安全的角度來說 具有重大意義。
【發明內容】
[0010] 【發明所要解決的課題】
[0011] 本發明所要解決的課題在于提供一種橡膠植物中的SRPP含量檢測方法，該檢 測方法利用表面等離子共振技術，特異性地識別橡膠草膠乳中橡膠粒子的表面膜蛋白 SRPP(小橡膠粒子蛋白），并通過收集SRPP與其抗體的結合所產生的信號，得到SRPP的含 量。
[0012] 本發明還提供一種高SRPP含量橡膠草品系的篩選技術，該篩選技術利用表面等 離子共振技術，特異性地識別橡膠草膠乳中橡膠粒子的表面膜蛋白SRPP(小橡膠粒子蛋 白），并通過收集SRPP與其抗體的結合所產生的信號，得到SRPP的含量。
[0013] 本發明的目的之一即利用SPR檢測SRPP含量，借此篩選出SRPP含量接近或超過 己西橡膠樹的橡膠草品系。
[0014] 本發明還提供一種SPR免疫傳感器，其包括巧片和固定于巧片上的SRPP抗體，所 述抗體優選為SRPP單克隆抗體。所述巧片上具有金膜和駿甲基葡聚糖。
[0015]【發明的效果】
[0016] 本發明利用表面等離子共振技術，借助抗原與抗體的特異性結合技術來識別橡膠 樹、橡膠草等橡膠植物膠乳中橡膠粒子的表面膜蛋白SRPP(小橡膠粒子蛋白），并通過收集 SRPP與其抗體的結合所產生的信號，得到SRPP的含量，解決了W往無法檢測橡膠植物中 SRPP含量的問題，同時解決了產膠橡膠草品系篩查的關鍵性技術問題。同時本發明具有快 速、準確、靈敏、低成本、簡便、可現場實施、不破壞植物等顯著優點。
[0017]具體地說，本發明的檢測方法和篩選方法的優點包括：
[001引1)快速，抗體固定好后每個樣品的檢測只需要幾分鐘；
[0019] 2)前處理簡便，樣品不需要復雜的前處理，只需要過膜或離屯、即可。
[0020] 3)特異性強，利用抗SRPP抗體尤其是單克隆抗體作為識別分子，可特異性識別 SRPP。
[002。 4)可實現SRPP含量的定量，例如，W某種常見天然橡膠植物的乳液中SRPP的SPR 信號值為基準，再通過SPR測其他樣品中的SRPP的SPR信號值，計算出其他樣品的信號值 與基準的比值，W該比值定量其他樣品中的SRPP含量。
[0022] 5)成本低，巧片可W再生后反復使用。
[0023] 6)采集乳液后可W現場測定。
[0024] 7)靈敏，即使將橡膠乳液稀釋到0. 5體積％，也能獲得明確的信號。
[00巧]最重要的是，目前尚未有檢測天然橡膠乳液中的SRPP技術。
[0026] 本發明可W實現特異性橡膠粒子膜蛋白識別，并快速判斷橡膠粒子膜蛋白的相對 含量，為有產膠潛力的橡膠草品系的篩選和進一步培育提供科學依據，故依據本發明，將有 望建立己西橡膠樹產膠替代方案W良好解決當前天然橡膠產量嚴重不足問題，因此，本發 明具有極為可觀的農業經濟效果，同時是解決國家天然橡膠戰略安全的關鍵技術之一。
【附圖說明】
[0027] 圖1為SPR免疫傳感器示意圖。
[002引圖2A示出不同抑值下的SPR響應值；圖2B示出不同抗體濃度下的SPR響應值。
[0029] 圖3示出不同純化橡膠乳液濃度（體積％ )下的SPR響應值。
[0030] 圖4示出由不同純化橡膠乳液濃度（體積％)與sra響應值得到回歸方程的一例。
【具體實施方式】
[0031]W下將更詳細地說明本發明。
[0032] 本發明的目的在于提供一種利用SPR檢測植物橡膠乳液內的橡膠粒子表面蛋白 SRPP的方法，該檢測方法包括如下步驟：
[0033] 1)對植物橡膠乳液進行預處理W除去植物橡膠乳液中的雜質；
[0034] 2)將SRPP抗體固定化于巧片表面；
[0035] 3)利用SPR技術檢測植物橡膠乳液中的SRPP。
[0036] <植物橡膠乳液的預處理〉
[0037] 植物橡膠乳液的預處理包括：自植物采集植物橡膠乳液后對天然橡膠粒子進行純 化來去除雜質，W獲得包含橡膠粒子的純化橡膠乳液，W及任選地對純化橡膠乳液進行水 洗。
[0038] 需要說明的是，本發明中，植物橡膠乳液采集自含有能夠制備橡膠的膠質乳液的 植物，例如，橡膠樹、橡膠草等產膠植物。
[0039] 本發明的橡膠樹包括己西橡膠樹等。
[0040] 本發明的橡膠草包括各種蒲公英屬植物等，例如俄羅斯品系蒲公英、海南品系蒲 公英、新疆品系蒲公英等。優選溫帶地區生長的蒲公英。
[0041] 在此需要說明的是，除去雜質的預處理是SPR檢測儀使用時所需要的。因為SPR 檢測儀運行時的通路很細，而且巧片上的各個反應區域也是微米級的反應池等，所W需要 物理上的預處理，將大粒度的物質除去。
[0042] <植物橡膠乳液的采集〉
[0043] 橡膠草的乳液可W自橡膠草的任意部位，優選采集自根部。對于橡膠樹而言，植物 橡膠乳液的采集可W采用天然橡膠乳液一般的采集方法。也可W采用下述的毛細管吸取 法。
[0044] 對于橡膠草而言優選的是，優選毛細管吸取法，在不破壞橡膠草的情況下現場提 取。毛細管吸取法具體地說，W蒲公英為例，蒲公英植物橡膠乳液的提取可W切開根部，然 后用毛細管吸取后，再用注射器打入離屯、管等收集容器里或過膜過濾。該個步驟的主要優 點是對于很少的樣品也能最大程度的取出，比破碎之類的方法效率高，而且相比于破碎法， 該步驟還能使橡膠草受到的傷害減少到最小的程度，并且可實現多次提取。
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