使用新鮮冰凍組織檢測單克隆抗體類藥物組織交叉反應的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測單克隆抗體類藥物組織交叉反應的方法，特別是涉及一種使 用新鮮冰凍組織檢測單克隆抗體類藥物組織交叉反應的方法。
【背景技術】
[000引單克隆抗體有特異性識別祀點的能力，具有藥效精確可控、副作用小的優點，單克 隆抗體類藥物作為一種新型的生物技術藥物具有特定的免疫性，如果除去本身特定的祀器 官外，正常組織細胞中存在相同或相似的抗原決定簇，單克隆抗體類藥物則可能與非祀器 官外的其他組織或細胞結合，從而產生嚴重的副作用。因此，單克隆抗體類藥物的組織交 叉反應在藥物臨床前的安全性評價中非常重要，現被廣泛的應用于生物學及醫學研究等領 域。
[0003] 然而在組織交叉反應試驗中，組織標本的處理是保證良好組織交叉結果的前提， 必須保證要檢測的組織取材新鮮，形態保存良好，抗原物質的抗原不丟失，不擴散或被破 壞。
[0004] 免疫組織交叉反應的組織標本主要包括石蠟切片和冰凍切片，然而在試驗中，要 求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因為作石蠟切片時需高溫烘片，可能會破壞組織的 抗原性，且石蠟切片包括取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、染色、封固一系列環節，操作步 驟不僅繁瑣，且若有某一環節的時間延長都會影響組織抗原的檢出強度，同時存在著組織 抗原免疫活性弱，切片質量不高，脫片嚴重等現象。
[0005] 因此，需開發出一種有效保存組織抗原免疫活性，提高切片質量，防止脫片現象的 單克隆抗體類藥物組織交叉反應檢測關鍵技術。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種使用新鮮冰凍組織檢測單克隆抗體類藥物 組織交叉反應的方法。該方法能夠較好地保存組織的抗原免疫活性，提高切片質量，防止脫 片，W及有效地簡化了組織交叉反應的操作步驟，加快實驗流程。
[0007]為解決上述技術問題，本發明的使用新鮮冰凍組織檢測單克隆抗體類藥物組織交 叉反應的方法，包括步驟：
[0008] (1)新鮮冰凍組織采集；
[0009] ( 2 )制備新鮮冰凍組織標本；
[0010] (3)將新鮮冰凍組織標本制作成新鮮冰凍組織切片；
[0011] (4)利用新鮮冰凍組織切片檢測單克隆抗體類藥物的組織交叉反應。
[0012] 所述步驟（1)中，采集的步驟為；使用解剖技術摘取新鮮組織，并剔除組織中多余 的脂肪及纖維，確保組織的完整及干凈。其中，組織包括；人和動物的組織，如可包括；食蟹 猴的大腦皮質，小腦淋己結、脾臟、肝臟、膜腺、小腸、肺臟、也臟、乳房、子宮、輸卵管、胎盤、 睪丸、前列腺、腎臟、皮膚、骨骼肌、甲狀腺、腎上腺、扁桃體、膀脫、結腸、主動脈上皮、卵巢、 垂體、脊髓、輸尿管、眼和胸腺等。
[0013] 所述步驟（2)中，制備的步驟具體如下：
[0014] 將液氮罐中注滿液氮，在不鎊鋼燒杯內加注4~7厘米高度的異戊焼，將該燒 杯放入液氮罐中，在金屬包埋模具(常規）底部涂抹少量冰凍組織包埋劑（0.C.T:化timal 化ttingTemperature),組織的欲取材面應朝向模具底端進行包埋，將標注有臟器識別信 息的包埋盒置于組織上，注入冰凍組織包埋劑，將包埋模具放入異戊焼中，靜止1~3分鐘， 確保整個組織被充分凍結，形成新鮮冰凍組織標本。
[0015] 另外，制備后的新鮮冰凍組織標本可保存在-8(TC超低溫冰箱中。
[0016] 所述步驟（3)中，將新鮮冰凍組織標本制作成新鮮冰凍組織切片的方法可參照 冰凍切片機說明書進行，其中，所述冰凍切片機的切片條件包括：冰凍切片機倉內溫度 為-1(TC~-3(TC，調整切片厚度至3~7ym。
[0017] 新鮮冰凍組織切片可保存在-8(TC超低溫冰箱中。
[0018] 所述步驟（4)中，檢測單克隆抗體類藥物的組織交叉反應的步驟如下：
[0019] 1)將新鮮冰凍組織切片放于室溫干燥15~30分鐘后，放于冰水混合物冷卻的丙 麗中固定15~30分鐘，然后，置于室溫干燥30~60分鐘；
[0020] 2)將干燥過的新鮮冰凍組織切片浸入0.0 lmol/L PBS(磯酸緩沖液）中2~3次， 每次1~2分鐘，或將新鮮冰凍組織切片放在0.0 lmol/L PBS中直至滴加試劑；
[0021] 3)在浸入過0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升的商品化 內源性生物素阻斷試劑盒中的卵白素試劑(購自福州邁新生物技術開發有限公司），置于濕 盒內在室溫下賠育10~20分鐘；
[002引 4)重復步驟2);
[0023] 5)在浸入過0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升內源性生 物素阻斷試劑盒中的生物素試劑，置于濕盒內在室溫下賠育10~20分鐘；
[0024] 6)重復步驟2);
[00巧]7)在浸入過0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升過氧化酶 阻斷劑，置于濕盒內在室溫下賠育5~15分鐘；
[0026] 8)將新鮮冰凍組織切片浸入去離子水中1~2次，每次1~2分鐘，然后浸入 0.0 lmol/LPBS中1~2次，每次1~2分鐘，或將新鮮冰凍組織切片放在0.0 lmol/L PBS 中，直至滴加試劑；
[0027] 9)在浸入過0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升動物非免 疫血清(羊)，置于濕盒內在室溫下賠育10~20分鐘后，將新鮮冰凍組織切片上的試劑漸除 并拭去新鮮冰凍組織切片周圍的試劑，滴加50~100微升的待檢測的單克隆抗體類藥物于 切片組織上，置于濕盒內在室溫下賠育60~90分鐘；
[0028]其中，單克隆抗體類藥物包括；人猿化單克隆抗體類藥物；待檢測的單克隆抗體 類藥物中的單克隆抗體的使用濃度一般為2~4y g/mL ;
[002引 10)重復步驟2);
[0030] 11)在浸入過0.0 lmol/L PBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升鏈霉菌 抗生物素蛋白-過氧化物酶，置于濕盒內在室溫下賠育10~20分鐘；
[0031] 12)重復步驟2);
[0032] 13)在浸入過0.Olmol/LPBS的新鮮冰凍組織切片上，滴加50~100微升DAB顯 色劑（即1XDAB試劑，由辣根過氧化氨酶DAB顯色試劑盒配制而成)，置于濕盒內在室溫下 賠育2~10分鐘后，用水沖洗2~3分鐘，并用蘇木素復染切片2~4分鐘，用水沖洗8~ 10分鐘，使用封片膠進行封片。
[0033] 14)顯微鏡下觀察反應結果。
[0034]上述步驟1) -13)中所涉及的試劑，可均為商業化產品。
[0035] 本發明的使用新鮮冰凍組織檢測單克隆抗體類藥物組織交叉反應的方法，提高了 冰凍組織制片技術、切片質量，降低免疫反應評價的困難度，便于操作具有廣泛的應用價 值。
【具體實施方式】
[0036] 本發明的使用新鮮冰凍正常食蟹猴組織檢測制藥公司制造的單克隆抗體類藥 物--生物素化鼠抗人CD34單克隆陽BEND/10]抗體（油30375)的組織交叉反應的方法， 包括步驟：
[0037] 1)新鮮冰凍食蟹猴組織采集
[0038] 使用解剖技術一一摘取正常健康食蟹猴的組織，并剔除組織中多余的脂肪及纖 維，確保組織的完整及干凈。解剖前，將食蟹猴進行放血處理，W避免組織切片時出現的冰 晶現象，便于切片的制備。其中，采用的放血方式可使用頸靜脈放血方式。
[0039] 2)制備新鮮冰凍組織標本
[0040] 將液氮罐中注滿液氮，在不鎊鋼燒杯內加注約