作為癌癥標志的甲基乙二醛的制作方法
【專利說明】作為癌癥標志的甲基乙二醛
[0001] 本發明公開了用于人或動物受試者中癌癥的新的、可靠的、靈敏的和便利的操作 診斷和預后試驗。發明人在本文中首次證實，具有癌癥的受試者的生物樣品中甲基乙二醛 (methylglyoxal)(MG)的水平增加與具有代謝活性的癌細胞發育和進展高度正相關。這 一結果強調，癌細胞產生和釋放顯著高于腫瘤和生物體細胞外液中正常細胞的MG的量，因 此，能夠從獨特的血樣中獲得癌癥的可靠和靈敏的診斷和預后試驗。本發明由此涉及用于 早期檢測和診斷癌癥以及用于在具有癌癥的受試者中預后評價、監測和作出治療決定的體 外方法；其通過測量MG的存在來進行。
【背景技術】
[0002] 隨著在全世界被診斷為癌癥病例數量的逐步增長和因該疾病晚期發現導致的死 亡數量持續增高，鑒定用于早期檢測和靶向治療干預的新生物標志（biomarker)被廣泛接 受為對癌癥預防和經治療的癌癥患者中的更好結果是決定性的。癌癥是全世界第二位死亡 率最高的原因，其中肺癌、結腸癌、乳腺癌（女性）、胰腺癌和前列腺癌（男性）最常見。
[0003] 目前，最常用的癌癥診斷和預后指示劑基于腫瘤的形態和組織學特征，因為沒有 可利用的具有足夠用于診斷的靈敏度和特異性的血液生物標志；且僅存在少量生物標志用 于癌癥的治療監測和預后評價。
[0004] 美國食品與藥品監督管理局（FDA)已經將生物標志定義為分子特征，它被客觀測 量和評價并且指示正常生物過程、致病過程或對治療干預的藥理學響應。這樣的生物標志 可以由腫瘤自身或身體對正常細胞轉化成癌性的惡性壓力作出響應而產生。根據美國國立 癌癥研宄所（NCI)，生物標志可以用于癌癥篩查、風險度評價、疾病的早期診斷、監測、預后 評價、作出治療決定和預測對療法的響應。
[0005] 然而，限制這種腫瘤學生物標志潛力的主要挑戰在于，癌癥發生和加速增長和腫 瘤發展是復雜的過程，其涉及各種異常遺傳和外遺傳的分子事件和細胞相互作用。
[0006] 惡性轉化導致特異性和非特異性表型細胞特征（signature)改變，由此導致生物 體中癌細胞的克隆選擇和進展。此外，癌癥可以因暴露于多種和不同環境致癌劑，例如化學 物質、福射和/或微生物中導致；尤其是在易感宿主中（Belpomme等人，Environ Res 2007 ; Irigaray 和 Belpomme, Carcinogenesis 2010)〇
[0007] 作為致癌過程的如此復雜性的結果，腫瘤在病因學和發病機制中廣泛改變，因此， 癌癥由超過200種侵害超過60種人體器官的不同的疾病組成。這種復雜性也是為什么盡 管許多生物測定尋找臨床腫瘤終點與生物標志之間的相關性，但是仍然幾乎沒有臨床有用 的生物標志（這些生物標志有助于腫瘤科醫生作出決定和患者護理）的原因，和無關鍵的 可利用的可以檢測所有甚至許多類型癌癥的單一生物標志的原因。本發明通過提供新的單 一生物標志協調了許多這些局限，所述生物標志允許通過在患者/受試者的生物樣品中進 行簡單測量來檢測許多類型的癌癥。這種測量非常具有再現性；以便檢測癌癥，甚至在早期 階段。
[0008] 本發明基本上在于測量代謝副產物甲基乙二醛（MG)的產生水平，其通過檢測和 定量來自受試者的生物樣品中這種分子的量來進行。
[0009] 圖1是顯示真核細胞中糖酵解代謝過程和甲基乙二醛（MG)形成的示意圖。
[0010] 能量的完整糖酵解途徑是厭氧的（不使用氧）。需氧條件中的正常細胞進入Krebs 三羧酸（TCA)循環而產生腺苷三磷酸（ATP);而仍然在需氧條件下，Warburg效應引導許多 癌細胞而不是進入Krebs TCA，從而增加糖酵解（即"需氧糖酵解"）。在糖酵解過程中，MG 途徑繞過傳統的糖酵解恩布頓-邁耶霍夫_帕納斯途徑并且是代謝盲路（cul-de-sac);因 此，這種途徑導致作為廢物終產物/副產物的MG和D-乳酸鹽形成，而糖酵解恩布頓-邁耶 霍夫-帕納斯途徑導致丙酮酸鹽形成，然后在需氧條件中導致Krebs TCA或在厭氧條件中 由丙酮酸鹽形成L-乳酸鹽。作為在許多癌細胞中的情況，Krebs TCA或呼吸鏈中的任何缺 陷通過二羥丙酮磷酸鹽形成增加來增加糖酵解以補償ATP產生和隨后的MG形成。
[0011] 圖Ibis顯示人癌細胞系（HCT16)的培養基中MG的產生取決于在培養基中存在低 或高葡萄糖濃度。通過使用液相色譜法-串聯質譜法（LC-MS/MS)分析對條件培養基（CM) 進行MG定量。相對于在低葡萄糖條件而言，在高葡萄糖條件下，癌細胞產生10倍更高的 MG，發現如下啟示，癌細胞的MG合成和釋放直接取決于葡萄糖消耗和代謝。
[0012] 圖2顯示通過使用直接組織分析、用MALDI-T0F/T0F質譜法在惡性PRO細胞克隆 中的MG產生。PRO細胞克隆最初得自由1，2_二甲肼施用誘導的結腸腺癌。在不染色和分 別使用掃描1和2中的蘇木精-曙紅-Safran(HES)染色后表示腫瘤。用MALDI-T0F/T0F 質譜法的MG瘤內檢測表示在分別得自91Da和118Da 2MQX分子碎片分析的掃描3和4中。 注意在壞死區中，在1和2中腫瘤的中部和下部中占優勢，3和4中的MG顯然較少被檢測 到，而顯然主要在用HES高度著色的一些區域中檢測到。
[0013] 圖3顯示具有癌癥的患者中MG血液水平與腫瘤階段之間的顯著正相關性。無論 癌癥階段如何，大多數MG血液水平值均高于0. 06 y M的MG的正常（非癌性的）對照值（p =0. 0109)，表明血液中的MG的全身測量是診斷癌癥的有效工具；關鍵是能夠便利和早期 檢測和篩查。
[0014] 圖4顯示癌癥患者與對照組（正常受試者或血糖正常的（經治療的）2型糖尿病 患者）之間血液MG與血糖比率（MG/G指數）的差異（p〈0. 01)。注意在正常對照組與具有 正常血糖的經治療的2型糖尿病的受試者之間的MG血液水平無顯著性差異。
[0015] 圖5公開了植入PRO致瘤的癌性結腸細胞后發育的BD-IX大鼠中MG血液水平與 腫瘤體積之間的顯著正相關性（p〈〇. 001)。PRO和REG細胞克隆最初來源于BD-IX大鼠中 1，2-二甲肼誘導的單一結腸腺癌。
[0016] 圖6顯示當皮下注入同系宿主時，PRO細胞如親代細胞誘導進行性腫瘤，而REG細 胞誘導在3周后退化的腫瘤。PRO細胞的腫瘤移植物與腫瘤體積的恒定進展相關，因此，注 意到MG血液水平與腫瘤體積之間的正相關性；移植后3周，存在MG血液水平恒定進展。移 植后3周REG癌細胞的腫瘤移植物被排斥，而血液中的MG在整個實驗期間保持在低水平。 通過比較使用PRO致瘤的癌細胞克隆得到的結果（圖5)，這啟示活躍進展的癌癥且更具體 地是增殖性致瘤的癌細胞合成大量MG ;而無進展的癌癥、更具體地是無增殖性無致瘤的癌 細胞則不能。
[0017] 圖7顯示在癌癥患者（B)中，MG血液水平與體重指數（BMI) (p = 0? 0064)顯著成 負相關性；而MG與BMI在正常受試者中不存在相關性（A)。這表明MG由癌細胞產生。
[0018] 圖8顯示在癌癥患者中，胰島素/葡萄糖比率（I/G)指數與MG血液水平之間存在 顯著的負相關性，而在正常健康受試者中的I/G指數保持恒定。因此，2種曲線的交叉點允 許臨界點的個體化，此時〇. 2 y M血液MG水平稱作"惡病質-相關的對照值"，高于它，胰島 素抵抗更高，而胰島素分泌更低（相對于正常受試者而言）；使得癌癥患者正在進入惡病質 或嚴重前-惡病質。
[0019] 表1顯示與用作對照組的正常受試者和具有正常血糖的經治療的2型糖尿病的患 者相比，癌癥患者中的MG血液水平平均值（土標準誤差和置信區間）（以yM計）。
[0020] 表2顯示根據腫瘤類型與用作對照組的正常受試者和具有正常血糖的經治療的2 型糖尿病的患者相比，癌癥患者中的MG血液水平平均值（土標準誤差和置信區間）（以yM 計）。
[0021] 表3公開了根據臨床響應在治療的癌癥患者中MG血液水平的平均值（土標準誤 差）（以UM計）；即，完全響應、部分響應或穩定/進行性疾病，正如通過使用成像技術的 直接臨床腫瘤和/或腫瘤測量值確定的。在具有如通過傳統成像技術確定的顯著完全臨床 響應的2位患者中，MG血液水平高于正常值。在這2位患者中，癌癥在3和7個月后復發。
[0022] 表4公開了根據其BMI在治療的不同癌癥患者中MG血液水平的平均值（土標準 誤差）（y M)。3種BMI類別之間的差異具有高度的統計學顯著性，且前-惡病質或惡病質 狀態（BMK18)與顯著更高的MG血液水平相關（相對于具有超重/肥胖癌癥（BMI>25)的 患者而言）。
[0023]生物樣品:本文所用的術語"生物樣品"是指得自患者或正常個體的各種樣品類 型，其用于診斷性監測試驗。所述生物樣品包括任意的細胞外液，例如血液、血清、血漿、尿 或其它液體樣品，例如唾液、腹膜液或胸膜液、腦脊髓液、胃液或結腸直腸流體、淋巴液、滑 液、間隙液、羊膜液、生理分泌物、淚液、粘液、汗液、乳、精液、陰道分泌物和來自潰瘍和其它 表面滲出的流體。它們也可以是實體組織，例如腫瘤或器官和例如得自子宮頸、骨髓、淋巴 結等的細胞涂片。術語"生物樣品"還包括構成生物體內胞外隔室的胞外基質和細胞外液。 它不僅包括臨床樣品，而且包括細胞培養物和組織培養物和來源于它們的細胞及其子代。
[0024]甲基乙二醛:在本發明中，"甲基乙二醛"是指如下發現，癌細胞產牛并目.釋放顯著 高于正常細胞所產生和釋放的量的甲基乙二醛（MG)，由此可以在生物體的腫瘤和細胞外液 中（特別是在MG從癌細胞中釋放后的外周血液中）測量和定量MG。
[0025] 通過體外測量自然存在于生物體中的游離MG部分或通過測量游離MG的總量證 實樣品中的MG，所測得的游離MG總量相當于自然存在于樣品中的除可以從通過已使用 與Chaplen類似或相同的技術處理樣品后可逆配體結合的MG中回收的MG之外的游離 MG(Chaplen 等人，Anal Biochem 1996 ;Chaplen 等人.，PNAS 1998)。最初研發這樣的方法 是為了測量胞內可逆配體-結合的MG。
[0026] 因此，通過本發明方法測量其水平的MG相當于在個體腫瘤或體液中、更特別是在 外周血液中測量的游離MG分子水平，其原因在于，它可以使得臨床應用生物標志極為簡 便。然而，如上所示，本發明的方法不僅唯一依賴于自然存在于生物體腫瘤或胞外隔室中的 游離MG的測量值，而且還依賴于在體外處理可逆配體-結合的MG之后回收的游離MG的測 量值。然而，當術語"MG"、"MG產生"或"MG產生水平"在本文中未進一步定義使用時，MG 水平相當于被視為自然存在于樣品中的游離分子，而不相當于可以從樣品中回收的游離MG 總量，不過，其測量值也包括在本發明中。
[0027] 術語"牛物樣品"包括其取得后以任意方式操作的樣品。
[0028] 可以在MG分析前"處理"所述生物樣品，例如通過：由血液制備血漿；從樣品中消 除細胞或使得細胞群富集；稀釋粘液流體等。本發明的方法可以包括過濾、蒸餾、濃縮、使干 擾化合物失活、細胞裂解；例如通過超聲處理、添加試劑、細胞固定或實體組織固定，然后進 行MG分析。所謂MG分析前經處理的樣品的實例使用用于回收胞內和/或胞外可逆配體結 合的 MG 的技術（Chaplen 等人，Anal Biochem 1996 ;Chaplen 等人，PNAS 1998)〇
[0029] 受試者、個體、患者:本文所用的術語"受試者"或"個體"是指任意年齡或性別的 無論是健康的還是患有疾病的人（或動物）；而術語"患者"是指具有疾病的受試者或個體， 例如具有癌癥或糖尿病的患者。
[0030] 術語'健康#試者'和'健康個體'是指已經通過使用常規的醫學檢驗證實無任 何可檢測到的疾病的無癥狀受試者或個體。更精確地，這些術語是指已經證實無癌癥、糖尿 病、慢性尿毒癥、動脈高血壓和阿爾茨海默病的人。
[0031] 癌癥或白血病:這@術語是指腫瘤，其細朐存在異常惡件表塑，其特征在于在牛物 體中主要包括自主生長和細胞增殖調節缺失的嚴格公認和經驗證的標志。近來更精確地綜 述和分析了這些標志（Hanahan和Weinberg, Cell 2011)。相反，術語"腫瘤"是指可以存在 惡性或非惡性表型的細胞。術語"良性腫瘤"用于表征這樣的腫瘤，其增殖能力保持受限， 因為細胞不包含惡性表型。
[0032] 對有關通過本發明方法鑒定的癌癥類型沒有特別限制；它們包括實體癌和非實體 癌，包括上皮或非上皮類型。
[0033] 上皮來源的癌癥包括所有組織學類型，例如腺癌和鱗狀細胞癌；和所有局部化癌， 例如頭頸癌（即口腔、舌、口咽、BB、喉等）、支氣管和肺癌、乳腺癌、胃癌、結腸直腸癌、胰腺 癌、肝癌（和所有其它消化道類型）、宮頸和子宮內膜癌、卵巢癌、泌尿生殖器癌（前列腺癌、 膀胱癌、腎癌）等。非上皮癌主要在于任意類型的白血病、淋巴瘤、黑素瘤或肉瘤。
[0034] 通過本發明也可以鑒定其它癌癥。例如，睪丸癌癥、無性細胞瘤、膠質母細胞瘤、星 形細胞瘤、間皮瘤、尤因肉瘤、兒童癌癥和HIV-相關腫瘤等。
[0035] 所謂癌癥的"早期檢測"在本文中應理解為是指無癥狀受試者中確定的亞臨床的 (無明顯可診斷的）顯微鏡可見的已經具有代謝活性的癌癥的檢測或鑒定。
[0036] 所謂癌癥的"籃查"應理解為是指在無癥狀個體群體中具有代謝活性的癌癥或癌 前期病變的全身檢測。
[0037] 所謂癌癥的"途逝"應理解為是指在有癥狀患者中已經具有肉眼可見的進行性癌 癥的檢測。本發明的檢測/診斷方法由此專用于檢測所謂的癌前期病變，這些病變可以在 組織活檢中證實，但可能不一定發展至確切的具有代謝活性的顯微鏡可見的癌癥。而本發 明易于且可靠地檢測到確切增殖和進行性癌癥。這可能以亞臨床的顯微鏡可見的病變的形 式發生在無癥狀受試者中或以更晚期的病變的形式發生在有癥狀受試者中，然后可以通過 通常可利用的臨床診斷工具所證實。由于MG水平涉及發展中的癌細胞的代謝活性，所以本 發明的檢測/診斷方法不僅可以用于在無癥狀受試者中篩查具有代謝活性的癌癥，而且可 以用于在有癥狀受試者中的增殖性癌癥的發展，且由此在這樣的受試者中評估癌癥將臨床 進展的可能性；然后可以通過通常可利用的臨床工具證實癌癥進展。
[0038] 本f所用的術語"MG iH常對照倌"或"MG參比倌"是