利用電化學檢測的免疫測定的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于檢測樣品中的分析物的免疫測定，并且尤其是涉及電化學傳感器 的免疫測定。
【背景技術】
[0002] 夾心（sandwich)測定形式因在樣品中的分析物的免疫學檢測而眾所周知。在夾 心測定中，分析物被夾在固定在固相上的捕獲抗體和游離在溶液中的標記的檢測抗體之 間。夾心測定通常需要，在檢測步驟以前洗掉多余的標記的檢測抗體，以使待檢測的信號產 生自抗體-分析物復合物而不是未結合試劑。
[0003] 減少為進行免疫測定所需要的步驟的數目（包括洗滌步驟）對于許多應用將是所 期望的。
【發明內容】
[0004] 本發明涉及以下免疫測定，在存在未結合試劑的情況下，其使用電化學傳感器來 檢測在樣品中的分析物。
[0005] 本發明的第一方面提供了用于檢測在樣品中的分析物的方法，包括：
[0006] a)提供電化學傳感器，包括：
[0007] 對照傳感元件，
[0008] 檢測傳感元件以及
[0009] 磁體，相對于對照傳感元件，其選擇性地吸引磁珠到檢測傳感元件，
[0010] 其中在暴露于檢測溶液之后，每個傳感元件產生信號，其指示在檢測溶液中并在 傳感元件處存在的酶標記的量，
[0011] b)將電化學傳感器暴露于檢測溶液，
[0012] 其中檢測溶液包含：
[0013] i)待測試分析物的存在的樣品，
[0014] ii)檢測抗體，附接于酶標記的該檢測抗體與所述分析物反應，以及
[0015] iii)分離抗體，附接于磁珠的該分離抗體與所述分析物反應，
[0016] 使得在樣品中存在分析物的情況下，在檢測溶液中形成免疫復合物，其包含分析 物、檢測和分離抗體、酶標記以及磁珠，以及
[0017] c)測量由檢測和對照傳感元件產生的信號，以及
[0018] d)由所述信號確定在檢測溶液中并在檢測傳感元件和對照傳感元件處酶標記的 量，
[0019] 其中相對于對照傳感元件，在檢測傳感元件處酶標記的量的增加指示在樣品中分 析物的存在或量。
[0020] 本發明的第二方面提供了用于檢測在樣品中的分析物的方法，包括：
[0021] (i)提供電化學傳感器，其包括對照和檢測傳感元件以及磁體，相對于對照傳感元 件，磁體選擇性地吸引磁珠到檢測傳感元件，
[0022] 每個傳感元件包括工作電極、對電極（反電極，counter electrode)、和可選的參 比電極，
[0023] 每個工作電極具有保持第一試劑和/或第二試劑的導電基質，上述第二試劑是用 于第一試劑的氧化劑或其前體；
[0024] 其中導電基質是導電含碳或含石墨基質或導電多孔基質以及在第一試劑和氧化 劑之間的反應是通過酶標記可催化的，從而提供在工作電極處的可檢測信號；
[0025] (ii)將對照和檢測傳感元件暴露于檢測溶液，其包含：
[0026] a)用于測試分析物的存在的樣品，
[0027] b)檢測抗體，附接于酶標記的該檢測抗體與所述分析物反應，以及
[0028] c)分離抗體，附接于磁珠的該分離抗體與所述分析物反應，
[0029] 使得在樣品中存在分析物的情況下，在檢測溶液中形成免疫復合物，其包含分析 物、檢測和分離抗體、酶標記、以及磁珠；以及
[0030] (iii)保持在檢測和對照傳感元件中在工作電極與對電極和/或參比電極（當存 在時）之間的電勢；以及
[0031] (iv)測量在檢測和對照傳感元件中在測試和對照工作電極與對電極和/或參比 電極（當存在時）之間通過的電流，
[0032] 相對于在對照傳感元件中在對照工作電極與對電極和/或參比電極（當存在時） 之間通過的電流的量，在檢測傳感元件中在工作電極與對電極和/或參比電極（當存在時） 之間通過的電流的量的增加指示在樣品中分析物的存在或量。
[0033] 本發明的第三方面提供了用于檢測在溶液中的分析物的電化學傳感器，包括：
[0034] 對照傳感元件，
[0035] 檢測傳感元件以及
[0036] 磁體，相對于對照傳感元件，其選擇性地吸引在溶液中的磁珠到檢測傳感元件，
[0037] 使得在暴露于溶液之后，每個所述傳感元件產生信號，其指示在溶液中并在傳感 元件處存在的酶標記的量。
[0038] 本發明的第四方面提供了如上所述的電化學傳感器在用于檢測分析物的方法中 的用途。
[0039] 本發明的第五方面提供了傳感裝置，包括：
[0040] 根據第三方面的電化學傳感器，
[0041] 采樣器，用于容納來自個體的樣品，以及可選地，將所述樣品引入電化學傳感器，
[0042] 電子閱讀器，用于依據由電化學傳感器的傳感元件產生的信號來確定在樣品中分 析物的量并提供指示所述量的輸出。
[0043] 本發明的第六方面提供了用于檢測分析物的試劑盒，包括：
[0044] 根據第三方面的電化學傳感器或根據第四方面的傳感裝置，
[0045] 檢測抗體，附接或可附接于酶標記的該檢測抗體與所述分析物反應，
[0046] 分離抗體，附接或可附接于磁珠的該分離抗體與所述分析物反應；以及
[0047]可選的一種或多種緩沖劑或其它試劑。
【附圖說明】
[0048] 圖1是根據本發明的一些實施方式的檢測的示意圖。
[0049] 圖2是如本文描述的傳感元件的示意圖。
[0050] 圖3示出在緩沖液中辣根過氧化物酶（HRP)標記磁珠的檢測。WE1是具有磁體的 傳感元件以及電極2是沒有磁體的傳感元件（如圖1所示）。
[0051] 圖4示出借助于檢測抗體在緩沖液中HRP標記磁珠的檢測。WE1是具有磁體的傳 感元件以及電極2是沒有磁體的傳感元件（如圖1所示）。
[0052] 圖5示出借助于比色檢測的C反應蛋白（CRP)珠測定的結果。
[0053] 圖6示出借助于洗滌和電化學檢測，對于0. 0 y g/mL CRP珠測定的電流對時間的 瞬態。WE1是具有磁體的傳感元件以及WE2是沒有磁體的傳感元件（如圖1所示）。
[0054] 圖7示出借助于洗滌和電化學檢測，對于0. 23 yg/mL CRP珠測定的電流對時間的 瞬態。WE1是具有磁體的傳感元件以及WE2是沒有磁體的傳感元件（如圖1所示）。
[0055] 圖8示出借助于洗滌和電化學檢測的CRP珠測定。WE1是具有磁體的傳感元件以 及WE2是沒有磁體的傳感元件（如圖1所示）。
[0056] 圖9示出借助于電化學檢測，對于0. 0 y g/mL CRP珠測定（沒有洗滌）的電流對 時間的瞬態。WE1是具有磁體的傳感元件以及WE2是沒有磁體的傳感元件（如圖1所示）。
[0057] 圖10示出借助于電化學檢測對于0? 23yg/mLCRP珠測定（沒有洗滌）的電流對 時間的瞬態。WE1是具有磁體的傳感元件以及WE2是沒有磁體的傳感元件（如圖1所示）。
[0058] 圖11示出借助于電化學檢測并且沒有洗滌的CRP珠測定。WE1是具有磁體的傳感 元件以及WE2是沒有磁體的傳感元件（如圖1所示）。
【具體實施方式】
[0059] 本發明涉及在免疫測定中電化學傳感器用于檢測在樣品中的分析物的用途。
[0060] 電化學傳感器可以用來定性或半定量地確定在配置傳感器的環境中存在的分析 物的量。例如，可以將電化學傳感器暴露于包含生物樣品或其部分的檢測溶液以檢測在樣 品或部分中分析物的存在和/或測量在樣品或部分中分析物的量。
[0061] 在一些實施方式中，電化學傳感器可以用來確定在樣品中分析物的水平是處于生 理水平（即在健康受試者中預期的水平）還是臨床水平（其是異常水平，或相關于疾病狀 態的水平）。
[0062] 電化學傳感器包括對照傳感元件和檢測傳感元件。用于傳感器的適宜的傳感元件 描述于W02010/055306,其全部內容以引用方式結合于本文。
[0063] 在暴露于檢測溶液之后，每個傳感元件產生信號，其指示在檢測溶液中并在傳感 元件處存在的酶標記的量。例如，信號可以指示在由傳感元件的電極限定的電解質空間中 的檢測溶液中存在的酶標記的量。
[0064] 檢測傳感元件伴隨有磁體，相對于對照傳感元件，其將在檢測溶液中的磁珠選擇 性地吸引到檢測傳感元件。換句話說，相比于到對照傳感元件，磁體將磁珠更強烈地吸引到 檢測傳感元件。優選地，磁體將在檢測溶液中的磁珠吸引到檢測傳感元件并且并不吸引磁 珠到對照傳感元件。
[0065] 可以根據電極的幾何形狀和間隔、電極傳感器基板的厚度、和磁珠的尺寸來調節 磁體的強度以優化磁珠到檢測傳感元件的選擇性吸引。在一些實施方式中，適宜的磁體可 以具有150至300g的強度，例如160、210、250或290g。
[0066] 用于如本文描述的電化學傳感器的適宜的磁體可容易獲自商業來源（例如 Supermagnete DE)并且包括鍍鎳（Ni-Cu-Ni)釹（NdFeB)磁體。
[0067] 如果分析物存在于樣品中，那么此分析物將存在于檢測溶液中。在檢測溶液中，檢 測和分離抗體結合于分析物。這種結合引起形成免疫復合物，其包含酶標記、磁珠和分析 物。因為它包含磁珠，所以磁體吸引上述免疫復合物到檢測傳感元件但并不到對照傳感元 件。因此免疫復合物被選擇性地吸引到檢測電極，從而在免疫復合物中存在的酶標記有助 于由檢測傳感元件產生的信號而不是由對照傳感元件產生的信號。因此，相對于來自對照 傳感元件的信號，在檢測溶液中分析物的存在引起來自檢測傳感元件的信號增加。
[0068] 相對于傳感元件來定位磁體，以相對于對照傳感元件，選擇性地吸引磁珠到檢測 傳感元件。換句話說，磁體的位置產生在傳感器中的磁場，其在檢測傳感元件處比在對照傳 感元件處更強，使得相比于對照傳感元件，磁珠被更強烈地吸引到檢測傳感元件。優選地， 定位磁體以在傳感器中在檢測傳感元件處但不在對照傳感元件處產生磁場，使得磁珠被吸 引到檢測傳感元件但不被吸引到對照傳感元件。
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