一種pla2r抗體定量檢測試紙條及制作、檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種PLA2R抗體定量檢測試紙條及制作、檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 膜性腎病按發病原因可分為特發性和繼發性膜性腎病，其診斷上要依靠臨床表現 及腎臟穿刺術。腎臟穿刺術是一種侵入式的診斷方法，對病人有一定的傷害。國外研宄發 現約75%的特發性膜性腎病患者可以通過血清學檢測檢出抗PLA2R抗體，國內也有文獻顯 示在國人中檢測陽性率更高，達到82%，而繼發性膜性腎病及其他類型腎小球疾病患者的 檢出率很低，健康人群均為陰性。血清學PLA2R抗體的定量檢測可以為特發性膜性腎病的 初篩和病情監測提供輔助作用。因此，開發非創傷、低風險、安全、廉價、精確和快速的PLA2R 定量測定試劑盒有極其重要的意義。
[0003] 免疫層析技術以多種膜材組合為固定相，作為液相的樣品通過毛細流原理從加樣 一端泳流至標記物墊上，與固定在標記物墊上的抗原或抗體標記物（如膠體金、熒光稀土 元素等）反應形成免疫復合物，該帶有標記的免疫復合物繼續通過涌流到達反應膜上固定 的檢測線，與檢測線上的抗原或抗體發生免疫反應從而被截留富集顯色，達到快速檢測的 目的。免疫層析技術最常見的標記物是膠體金，應用非常廣泛，也非常成功。由于膠體金標 記是通過靜電吸附的原理，在流體中不穩定，標記的分子容易脫落，且只有膠體金顆粒富集 到一定肉眼可見的量的時候才能判讀，同時，膠體金免疫層析技術只可對被檢物定性分析。 目前，通過膠體金免疫層析技術來快速檢測磷脂酶A2受體（PLA2R)抗體的只有在公布號為 CN102159951A中國專利申請中提到，但如上所述，不能定量且膠體金穩定性差。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種PLA2R抗體定量檢測試紙條及制作、檢測方法，能夠 準確、快速、靈敏、定量的檢測人血中的PLA2R抗體。
[0005] 本發明解決其技術問題，所采用的技術方案是提供一種PLA2R抗體定量檢測試紙 條及制作、檢測方法。具體的，包括一個檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括PLA2R抗體檢測 卡及樣品緩沖液，PLA2R抗體檢測卡內裝有PLA2R抗體檢測試紙條。檢測卡可由熒光分析 儀測出PLA2R抗體濃度值。所述試紙條包括在粘性底板上依次搭接的樣本墊、結合物墊、硝 酸纖維素膜和吸水紙；所述的結合物墊上噴涂有抗人IgG抗體偶聯的量子點，所述的硝酸 纖維素膜上包被有PLA2R抗原作為檢測線，硝酸纖維素膜上還包被有抗抗體作為質控線， 所述抗抗體為抗量子點偶聯抗體的抗體。檢測卡是以間接法模式檢測PLA2R抗體。
[0006] 所述PLA2R，可以是天然純化的PLA2R，也可以是基因重組獲得的PLA2R或PLA2R 片段；PLA2R抗體是由PLA2R免疫動物所得到的PLA2R抗體，可以是諸如兔源、羊源或其他 哺乳動物來源的多克隆抗體，也可以是鼠源單克隆抗體。
[0007] 量子點偶聯的抗人IgG抗體，可以是抗人不同IgG亞型的抗體，如鼠抗人IgG4抗 體。該抗人IgG抗體可以是諸如兔源、羊源或其他哺乳動物來源的多克隆抗體，也可以是鼠 源單克隆抗體。質控線上的抗抗體是抗量子點偶聯抗體的抗體。例如若量子點偶聯的抗體 是鼠抗人IgG4抗體，那么該抗抗體必須是抗鼠的抗體；又如若量子點偶聯的抗體是羊抗人 IgG抗體，那么該抗抗體必須是抗羊的抗體；
[0008] 所述量子點為包括IB、IIB、IIIA、IVA、VA、VIA族中的兩種以上元素組成的單 個晶核結構，如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、InP、InAs、HgCdTe等，或是核殼結構，如CdSe/ZnS、 ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
[0009] 量子點由以上元素構成外，還具有表面修飾基團，如-C00H、-NH2、-SH、-CH0等基 團，可以通過一些化學試劑如戊二醛、碳二亞胺等偶聯生物大分子，如蛋白質、核酸及其他 有機分子。
[0010] 所述量子點的粒徑范圍為2~lOOOnm，激發光波長范圍為200~600nm，發射光波 長為400~800nm。
[0011] 一種PLA2R抗體檢測試紙條的制作方法，包括以下步驟：
[0012] a.用量子點偶聯抗人IgG抗體得到量子點-抗人IgG抗體復合物，并將其噴涂在 結合物墊上；
[0013]b.分別將PLA2R包被到硝酸纖維素膜上作為檢測線，將抗抗體包被到硝酸纖維素 膜上作為質控線，檢測線和質控線間的距離為3~10mm。
[0014]c.在粘性底板上依次搭接樣本墊、噴涂有量子點-抗人IgG抗體復合物的結合物 墊、設置有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜、吸水紙，并裁切成所需寬度即為PLA2R抗體檢 測試紙條。
[0015] 檢測線和質控線的制備方法為：分別用0. 005-0. 2M，pH6. 0-pH9. 0的包被緩沖液 稀釋PLA2R和抗抗體至0.l-5mg/ml，所述包被緩沖液為磷酸鹽、硼砂、碳酸鹽、可含糖、醇類 中的一種；用劃膜儀或噴膜儀分別將PLA2R和抗抗體包被到硝酸纖維素膜上，包被濃度為 0. 4-2y1/cm;噴涂完畢后，放置在環境濕度為30%以下，溫度在16°C_45°C的環境中，烘干 lh以上，封存。
[0016] 抗人IgG抗體偶聯量子點的方法：將抗人IgG抗體加入到量子點溶液中或是將量 子點加入到抗人IgG抗體溶液中偶聯得到量子點-抗人IgG抗體復合物；所述量子點可在 適當的溶液中活化，活化試劑可以為EDC、NHS或戊二醛或其他交聯劑等，將量子點與活化 劑結合即的量子點溶液。
[0017] 結合物墊上噴涂量子點-抗人IgG抗體復合物的條件是：將量子點-抗人IgG抗 體復合物稀釋稀釋5-200倍，用噴膜儀按2-100y1/cm的量噴涂到結合物墊上，在環境濕度 小于30%，溫度在35-37°C的環境下烘烤l_5h，干燥后封存。
[0018] 所述PLA2R抗體檢測卡，包括上殼體和下殼體，所述上殼體與下殼體間放置 有PLA2R抗體檢測試紙條，所述上殼體上設置有加樣孔、觀察窗和信息區，所述加樣孔與 PLA2R抗體檢測試紙條上的樣本墊對應，觀察窗與硝酸纖維素膜上的檢測線和質控線對應； 所述信息區上噴涂有用于識別病人ID的二維碼、條形碼或磁卡；所述PLA2R抗體檢測卡同 樣品緩沖液一起裝在試劑盒內，試劑盒上設置有標定芯片。
[0019] 本發明還提供了一種PLA2R抗體的檢測方法：包括以下步驟：
[0020] 1)先用試劑盒上的標定芯片標定熒光分析儀，保存標定數據；
[0021] 2)取10微升血清或血漿樣品，或15微升全血樣品加入樣品緩沖液，混合后10秒 鐘，加入檢測卡加樣孔；
[0022] 3)將檢測卡插入熒光分析儀的檢測孔，放置3-4分鐘，熒光分析儀即可讀出PLA2R 的濃度值。
[0023] 有益效果：將量子點和免疫層析技術相結合，可使試紙條既具有穩定性高的優點， 同時，又可對PLA2R抗體進行定量檢測，且檢測又靈敏度高；該檢測方法還具有檢測時間 短，效率高的特點。相對于傳統的膠體金和有機熒光染料，量子點具有穩定、可定量的優點， 因此，可以很好的檢測出PLA2R抗體的存量。本發明利用量子點免疫層析法，非創傷、低風 險、安全、廉價、精確和快速的定量檢測血清、血漿和全血中的PLA2R抗體含量，可以為特發 性膜性腎病的初篩和病情監測提供輔助作用。
【具體實施方式】
[0024] -種檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括PLA2R抗體檢測卡及樣品緩沖液，PLA2R抗 體檢測卡內裝有PLA2R抗體檢測試紙條。所述試紙條包括在粘性底板上依次搭接的樣本 墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水紙。所述的結合物墊上噴涂有抗人IGG抗體偶聯的量子 點，所述的硝酸纖維素膜上包被有PLA2R抗原作為檢測線，硝酸纖維素膜上還包被有抗抗 體作為質控線，所述抗抗體為抗量子點偶聯抗體的抗體。檢測卡是以間接法模式檢測PLA2R 抗體。。
[0025] 所述PLA2R，可以是天然純化的PLA2R，也可以是基因重組獲得的PLA2R或PLA2R 片段；PLA2R抗體是由PLA2R免疫動物所得到的PLA2R抗體，可以是諸如兔源、羊源或其他 哺乳動物來源的多克隆抗體，也可以是鼠源單克隆抗體。
[0026] 量子點偶聯的抗人IgG抗體，可以是抗人不同IgG亞型的抗體，如鼠抗人IgG4抗 體。該抗人IgG抗體可以是諸如兔源、羊源或其他哺乳動物來源的多克隆抗體，也可以是鼠 源單克隆抗體。質控線上的抗抗體是抗量子點偶聯抗體的抗體。例如若量子點偶聯的抗體 是鼠抗人IgG4抗體，那么該抗抗體必須是抗鼠的抗體；又如若量子點偶聯的抗體是羊抗人 IgG抗體，那么該抗抗體必須是抗羊的抗體。
[0027] 所述量子點為包括IB、IIB、IIIA、IVA、VA、VIA族中的兩種以上元素組成的單 個晶核結構，如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、InP、InAs、HgCdTe等，或是核殼結構，如CdSe/ZnS、 ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
[0028] 量子點由以上元素構成外，還具有表面修飾基團，如-C00H、_NH2、-SH、-CH0等基 團，可以通過一些化學試劑如戊二醛、碳二亞胺等偶聯生物大分子，如蛋白質、核酸及其他 有機分子。
[0029] 所述量子點的粒徑范圍為2~lOOOnm，激發光波長范圍為200~600nm，發射光波 長為400~800nm。
[0030] 所述PLA2R抗體檢測卡，包括上殼體和下殼體，所述上殼體與下殼體間放置 有PLA2R抗體檢測試紙條，所述上殼體上設置有加樣孔、觀察窗和信息區，所述