一種基于核酸適體包裹的金納米粒子探針比色檢測氧化樂果的試劑及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于比色試劑研宄領域,涉及一種基于核酸適體包裹的金納米粒子探針比色檢測氧化樂果的試劑及應用。
【背景技術】
[0002]氧化樂果在農業中廣泛應用,但是其毒性和不合理利用也使得其在水體、土壤、空氣和食物中大量殘留,造成環境污染。氧化樂果能夠抑制血液、唾液及組織中的神經遞質膽堿酯酶的活性,從而損傷人和動物的神經系統,危害人類和動物的健康。
[0003]目前的氧化樂果殘留檢測方式有很多,包括液相色譜、氣相色譜、氣-液連用、質譜、表面增強拉曼光譜、聲表面波等,這些檢測方法雖然有較高的靈敏度和可靠性,但是需要有復雜的樣品準備過程以及龐大和昂貴的檢測設備,以及復雜的檢測過程。
[0004]電化學和光學生物檢測方法憑借快速、高效、簡便、靈敏的特點得到廣泛的研宄。目前檢測氧化樂果的方法主要有酶法,分為抑制型和水解型;單酶和多酶法等。抑制型酶法是利用氧化樂果對乙酰膽堿酶的抑制作用對有機磷進行檢測的;而水解型法是直接利用水解酶水解氧化樂果,對水解產物進行檢測而實現氧化樂果檢測的。單酶型法只使用一種酶對氧化樂果進行檢測;而多酶型法是兩種及以上的酶聯用對氧化樂果實現檢測。在酶型氧化樂果檢測方法的設計中,還引入了各種納米材料,如碳納米管、金屬納米粒子、量子點等對信號進行放大,從而提高檢測的靈敏度。然而,酶分子的儲存和活性條件較為苛刻,影響著酶的應用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為快速而簡便地檢測氧化樂果的殘留,提供一種基于核酸適體包裹的金納米粒子探針比色檢測氧化樂果的試劑。
[0006]實現本發明目的的技術解決方案為:一種基于核酸適體包裹的金納米粒子探針比色檢測氧化樂果的試劑,所述試劑通過以下步驟制備:
[0007]在濃度為1_3ηΜ的金納米粒子溶液中加入2_5 μ M濃度的核酸適體溶液,反應Ih以上,8000-12000rpm離心,以濃度為不高于0.1M的PBS溶液重懸得到所述試劑;其中,核酸適體的序列為:5’ -AGC TTG CTG CAG CGA TTC TTG ATC GCC ACA GAG CT-3’。
[0008]金納米粒子溶液中金納米粒子的粒徑為13nm。
[0009]一種基于核酸適體包裹的金納米粒子探針比色檢測氧化樂果的試劑盒,包括上述步驟制備的試劑和鹽溶液,其中,鹽溶液為NaCl溶液或KCl溶液;試劑和鹽溶液中的總鹽濃度在0.02-0.1M之間。
[0010]一種基于核酸適體包裹的金納米粒子探針比色檢測氧化樂果的試劑盒的應用,所述的應用是在試劑中加入待測的氧化樂果溶液后靜置10-60秒,然后加入鹽溶液,靜置1-5分鐘后進行檢測。
[0011]本發明與現有技術相比,具有以下優點:
[0012]1、檢測靈敏度高:本發明對氧化樂果的檢測下限低于0.2 μΜ,比現有的氧化樂果檢測靈敏度更高。
[0013]2、檢測體系簡單:本發明使用的試劑盒能夠使用肉眼對顏色變化的觀察來實現氧化樂果的檢測,檢測方式簡單易行。
[0014]3、實際應用性強:本發明使用的氧化樂果試劑盒對氧化樂果有很好的檢測效果,在土壤模擬樣本中也有很好的檢出率,在環境保護和家庭農藥殘留方面有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0015]圖1是本發明基于核酸適體包裹金納米粒子探針比色檢測氧化樂果試劑盒的檢測原理示意圖。
[0016]圖2是本發明實施例1中的試劑制備結果圖,a為吸附核酸適體前的吸光度曲線,b為吸附核酸適體后的吸光度曲線。
[0017]圖3是本發明實施例2中的試劑的檢測效果對比圖,分別為金納米粒子(a)、試劑(b)、試劑與氧化樂果混合物(C)加入NaCl溶液后的吸光度曲線。
[0018]圖4是本發明實施例3中對隨機核酸(對照試劑)和核酸適體(試劑)制備的金納米粒子探針溶液檢測同一濃度氧化樂果的對比圖。
[0019]圖5是本發明實施例4中的對不同濃度氧化樂果的檢測效果圖,其中A為吸光度曲線圖,B為A615/A521對氧化樂果濃度的對數關系圖。
[0020]圖6是本發明實施例5中的對同一濃度的氧化樂果和水胺硫磷、甲胺磷、皮蠅磷的吸光度對比圖。
[0021]圖7是本發明實施例6中在緩沖溶液和土壤浸出液模擬樣本中氧化樂果的A615/A521對比圖。
【具體實施方式】
[0022]下面通過實施例對本發明作進一步的說明,其目的是為了更好理解本發明的內容,但所舉的實施例并不限制本發明的保護范圍:
[0023]基于核酸適體包裹的金納米粒子探針比色檢測有機磷的核酸適體檢測氧化樂果的基本原理如圖1所示:當金納米粒子溶液中的鹽溶液濃度達到一定高度之后,金納米粒子會反生聚沉;而核酸適體能夠通過靜電作用吸附在金納米粒子的表面,從而提高金納米粒子的穩定性;當氧化樂果與核酸適體競爭性結合之后,金納米粒子表面再次裸露,其穩定性會下降,氧化樂果的濃度不同,金納米粒子的穩定性下降程度也不同;根據金納米粒子的聚沉程度的不同可以判斷氧化樂果的濃度。
[0024]實施例1:試劑的制備及其結果
[0025]基于核酸適體包裹的金納米粒子探針比色檢測氧化樂果試劑的制備步驟如下:將100mL的金納米粒子溶液離心濃縮至500 μ L,其終濃度約為2nmol/L ;緩慢加入10 μ L濃度為100 μ mo I/L的核酸適體溶液,其終濃度為2 μ mo I/L ;以350rpm轉速振蕩反應I小時后,以1000rpm轉速離心15分鐘,加入0.01mol/L PBS (PH = 7)重懸,制得試劑。對制備的試劑進行紫外檢測,考察其粒徑變化,其結果如圖2所示,a為吸附核酸適體前的吸光度曲線,b為吸附核酸適體后的吸光度曲線,表明在吸附核酸適體前后金納米粒子的粒徑沒有發生很大的變化,也即在制備過程中很好地控制了團聚現象。
[0026]實施例2:試劑盒比色檢測氧化樂果的檢測效果
[0027]試劑盒的制備及使用方法:分別往氧化樂果和試劑的混合物、金納米粒子溶液和試劑加入鹽溶液后進行檢測,試劑的制備步驟實施例1中所述,其中90 μ I的金納米粒子溶液中直接加入10 μ I濃度為0.2Μ的NaCl溶液,靜置I分鐘后進行紫外可見分光吸收光譜檢測;90 μ I的試劑中直接加入10 μ I濃度為0.2Μ的NaCl溶液,靜置I分鐘后進行紫外可見分光吸收光譜檢測;90 μ I的試劑中先加入10 μ I濃度為50 μ M的氧化樂果溶液得到混合物,靜置10秒后加入?ο μ I濃度為0.2Μ的NaCl溶液,靜置I分鐘后進行