一種基于表面增強拉曼散射的微流控檢測芯片的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基于表面增強拉曼散射的微流控檢測芯片。
【背景技術】
[0002] -束單色光在入射到不均勻的介質時會被介質分子散射，如入射光的頻率、光子 能量大小和光子方向均發生改變時，我們稱該非彈性散射為拉曼散射。拉曼散射光譜可被 用于表征分子的振動能級，在化學、物理學、生物醫學等領域均有著重要的應用。在采用拉 曼散射光譜進行檢測時對待檢樣品狀態無特殊要求，液相、固相、氣相樣品均可測定，且具 有非接觸、對樣品無破壞性的優點，因此在生物樣品分析、醫學檢測、環境監測等方面有著 巨大的應用潛力。
[0003] 然而，在激光光源問世前，由于拉曼散射光譜分析的靈敏度太低，一度阻礙 了這種分析手段的應用。自1974年弗萊希曼（Fleischman M, et al, Chem. Phys. Lett. 1974, 26, 163-166)等研究人員首次在粗糙的銀電極表面觀察到吡啶分子的增強拉曼 散射信號以來，這種新的表面光化學效應-表面增強拉曼散射（Surface Enhanced Raman SCattering，SERS)為拉曼散射光譜在分析領域，特別是在超靈敏生物醫學檢測中的應用起 到了重要的推動作用。表面增強拉曼散射是指在以粗糙的貴金屬（如金、銀、銅等）或其納 米溶膠為基底表面對待檢物分子進行分析時能得到顯著增強的拉曼散射光譜信號。表面增 強拉曼散射的增強數量級極高，本實驗室以細菌為模板合成的中空多孔銀微球作為基底對 巰基吡啶進行檢測，最低檢測限可達l〇_ 15M，增強因子達到1011 (Dapeng Yang，et al，Green Chem. 2010, 12, 2038-2042)。
[0004] 免疫層析檢測技術是上世紀80年代發展起來的一種生物分析手段，以膠體金、膠 體硒、著色乳膠微球等標記抗體或抗原后為示蹤探針，當液態待檢樣本在毛細作用驅動下 依次通過樣品墊、示蹤探針墊、固化有靶配體的硝酸纖維素膜、吸水墊時在硝酸纖維素膜上 捕獲并呈色相應的靶分子。該技術具有制備成本極低、操作簡單(只有加樣一個操作步驟)、 檢測通量靈活和快速（15分鐘內得到結果)的優點，因而在生物醫學檢測領域得到了廣泛的 應用。但是，由于上述常見的標記材料和基于硝酸纖維素膜檢測方案固有的限制，該技術檢 測靈敏度較低，且無法進行靶分子的精確定量分析。
[0005] 截至目前，已有多種不同的基于表面增強拉曼散射光譜分析的微流控芯片方案用 于分析領域，如專利申請號為201110131032. 1的專利《微流控表面增強拉曼散射檢測器件 及其制備方法與應用》，采用基于納米凹孔表面粗糙化活性基底所制備的微流控芯片；專利 申請號為201010117672. 2的專利《一種基于表面增強拉曼散射活性基底的微流控檢測器 件》，采用在襯底上制備納米柱或納米纖維直立結構并濺射金屬納米顆粒層得到表面增強 拉曼散射活性基底來構建微流控檢測器件；又如專利申請號為201110040128. 7的專利《一 種陣列型微流控表面增強拉曼散射專用檢測芯片的分析系統》，采用多點陣活性反應區固 化不同的腫瘤標志物，利用各種腫瘤標志物的拉曼指紋圖譜庫來進行多標志物的無標記腫 瘤標志物分析；再如申請號為200610008767. 4的專利《具有表面增強拉曼散射光譜活性基 底的微流控芯片及制備方法》，采用物理蒸發、濺射或化學沉積的方法結合掩膜技術制備幣 族金屬薄膜層來制備具有表面增強拉曼散射光譜活性基底的微流控芯片等等。采用外源性 驅動力來驅動待檢樣品的進樣，該類專利的設計方案必須在配套的檢測儀中設置樣品驅動 模塊，使得檢測儀的設計復雜化，同時也提高了檢測儀的制備成本。從實際應用的角度出 發，功能模塊的增加也會增加設備的重量，降低設備的便攜性。此外，高深寬比的垂直孔狀 結構或長徑比的垂直柱形結構在加工制備過程中也不利于濺射或沉積金屬層，增加了制備 加工的復雜度。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種基于表面增強拉曼散射的微流控檢測芯片。
[0007] 本發明提供的一種微流控檢測芯片，是基于表面增強拉曼散射的原理制成的，該 微流控檢測芯片由可產生毛細驅動力的材料、活性基底、結合物墊和樣品墊按照所述順序 依次搭接固定在載體上而成；
[0008] 所述載體可為任何用于試紙條制備或芯片制備的載體，具體可如塑料殼體；
[0009] 所述結合物墊為固化有外源性拉曼探針的聚酯薄膜或玻纖膜；
[0010] 所述固化的方式為非化學鍵結合；
[0011] 所述外源性拉曼探針為能與待檢物質相互作用的配體和具有拉曼活性的外源性 分子共同包覆的貴金屬納米粒子構成的祀向性探針；
[0012] 所述靶向性是指特異性針對待檢物質；
[0013] 所述活性基底為在表面增強拉曼散射分析時所用基底的表面上設置測試區和質 控區而得到的；
[0014] 所述測試區上連接有所述能與待檢物質相互作用的配體，質控區上連接有不能與 待檢物質相互作用、但能與所述待檢物質相互作用的配體結合的物質；
[0015] 所述測試區在所述結合物墊一側，質控區在所述可產生毛細驅動力的材料一側；
[0016] 所述活性基底的測試區上能與待檢物質相互作用的配體可以與待檢物質結合，待 檢物質又與所述外源性拉曼探針上的能與待檢物質相互作用的配體結合，通過雙抗體夾心 法將外源性拉曼探針固定在檢測區上，通過檢測外源性拉曼探針上的外源性分子的特征性 拉曼散射峰強度反應待檢物質的含量；
[0017] 所述活性基底的質控區上的不能與待檢物質相互作用、但能與待檢物質相互作用 的配體結合的物質可以與外源性拉曼探針上的能與待檢物質相互作用的配體結合，不需要 通過待檢物質就可以將外源性拉曼探針固定在質控區，通過檢測外源性拉曼探針上的外源 性分子的特征性拉曼散射峰強度對微流控芯片進行質控。
[0018] 上述芯片中，所述可產生毛細驅動力的材料為濾紙、玻纖膜或高分子吸水材料；
[0019] 所述樣品墊為玻纖膜；
[0020] 所述貴金屬納米粒子為納米金粒子或納米金棒；
[0021] 所述能與待檢物質相互作用的配體通過包括金硫鍵在內的作用與納米金粒子連 接；
[0022] 所述外源性分子通過包括金硫鍵在內的作用與納米金粒子連接；
[0023] 所述在表面增強拉曼散射分析時所用基底為表面覆有貴金屬薄層的具有向上突 出的尖錐狀結構陣列的聚合物厚膜或板；
[0024] 所述聚合物為能在一定條件下固化成型的聚合物；
[0025] 所述尖錐的錐洞頂部為任意封閉性幾何圖形。
[0026] 所述封閉性幾何圖形具體為三角形，梯形，橢圓形或圓形；
[0027] 所述尖錐狀結構陣列為微尖錐結構陣列；
[0028] 所述微尖錐結構陣列中的錐體高度為20-500微米，錐底面積為225-250000平方 微米；
[0029] 所述貴金屬薄層的厚度為30_300nm;
[0030] 所述聚合物厚膜或板的厚度為100-3000um;
[0031] 所述能在一定條件下固化成型的聚合物為聚酰亞胺或聚二甲基硅氧烷；
[0032] 所述能與待檢物質相互作用的配體為抗體或抗原。
[0033] 上述任一所述的芯片中，所述具有拉曼活性的外源性分子為5, 5'二硫代雙（2-硝 基苯甲酸）；
[0034] 所述待檢物質為蓖麻毒素；
[0035]所述抗體為抗蓖麻毒素多克隆抗體；
[0036] 所述不能與待檢物質相互作用、但能與待檢物質相互作用的配體結合的物質為羊 抗兔多克隆抗體；
[0037] 所述表面覆有貴金屬薄層的具有向上突出的尖錐狀結構陣列聚合物厚膜或板是 先經過巰基羧基雙功能化的聚乙二醇功能化的聚合物厚膜或板；
[0038] 所述巰基羧基雙功能化的聚乙二醇通過金硫鍵連接在所述表面覆有貴金屬薄層 的具有向上突出的尖錐狀結構陣列聚合物厚膜或板上；
[0039] 所述抗蓖麻毒素多克隆抗體和羊抗兔多克隆抗體通過酰胺鍵連接在巰基羧基雙 功能化的聚乙二醇上，進而固定在所述表面覆有貴金屬薄層的具有向上突出的尖錐狀結構 陣列聚合物厚膜或板上；
[0040] 所述聚合物為聚二甲基硅氧烷；
[0041] 所述聚合物厚膜或板的厚度為5000 i! m;
[0042] 所述貴金屬為金；
[0043] 所述貴金屬薄層的厚度為200nm;
[0044] 所述封閉性幾何圖形為圓形；
[0045] 所述圖形直徑為50 iim，圓形和圓形之間的距離為30μm。
[0046] 所述結合物墊長為3mm，寬為2mm;
[0047] 所述樣品墊長為3mm，寬為2mm;
[0048] 所述高分子吸水材料長為5,寬為2mm;
[0049] 所述活性基底長為4mm，寬為2mm。
[0050] 上述任一所述的芯片中，所述外源性拉曼探針的制備方法如下：將所述能與待檢 物質相互作用的配體加入所述貴金屬納米粒子溶液中，溫育，離心棄上清得沉淀；用含有 BSA的pH7. 4的0. 1M的PBS重懸沉淀物，加入所述具有拉曼活性的外源性分子，反應，離心 得沉淀；將其重懸于含有BSA、PEG20000、Na 3N、蔗糖、海藻糖和Tween-20的10mM pH7. 4的 PBS緩沖液中，得到所述外源性拉曼探針溶液；
[0051] 所述結合物墊按照如下方法制備：將所述聚酯薄膜或玻纖膜浸入所述外源性拉曼 探針溶液中，干燥過夜即得；
[0052] 所述BSA的作用是封閉能與待檢物質相互作用的配體和外源性分子包覆貴金屬 納米粒子后的剩余活性位點；
[0053] 所述活性基底按照如下方法制備：用Piranha溶液浸泡所述在表面增強拉曼散射 分析時所用基底，洗凈，再將其浸入巰基羧基雙功能化的聚乙二醇水溶液中反應，得到功能 化后的基底；用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）_碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺將能與 待檢物質相互作用的配體偶聯在功能化的基底上制成測試區，同樣將不能與待檢物質