一種pH釋放型免疫傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種pH釋放型免疫傳感器的制備方法及應用。具體是將氧化還原探針硫堇封裝在介孔二氧化娃-Au中，利用硫堇的氧化還原特性來對腫瘤標志物進行檢測，制備一種檢測腫瘤標志物的釋放型免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]目前電化學免疫傳感器已經廣泛應用于腫瘤標志物的檢測，釋放型免疫傳感器是一種比較新穎的檢測腫瘤標志物的方法，因此受到更加廣泛的關注。
[0003]近年來，介孔硅材料由于其具有較大的比表面積，較高的孔容和可調節的孔徑，受到了吸附、傳感等領域的廣泛關注。因此，利用其具有良好的吸附性能來對硫堇進行吸附，并用羧基功能化金Au-COOH對其孔道進行封閉，使得硫堇穩定在介孔二氧化硅的孔道內，介孔二氧化硅-Au作為傳感器制作中的檢測抗體標記物，制得檢測腫瘤標志物的免疫傳感器，利用PH控制孔道的開和關，來達到檢測的目的。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一是制備一種pH釋放型免疫傳感器。
[0005]本發明的目的之二是將該pH釋放型免疫傳感器應用于腫瘤標志物的檢測。
[0006]本發明的技術方案
1.一種pH釋放型免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉對磁電極進行拋光處理，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2-0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ；
(2)取6μ?,Ο.5-3 mg/mL的氨基化四氧化三鐵溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；
(3)滴加3PL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶液與N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶液的混合液到電極表面，再繼續滴加6 μ?、5~10 Pg/mL的腫瘤標志物捕獲抗體，4°C下晾干，超純水沖洗；
所述1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶液與N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶液的濃度均為0.1 mol/L，其體積比為1~4:1;
(4)用3PL、質量分數為0.5-1%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，4°C下晾干，超純水沖洗；
(5)將6μ?的一系列不同濃度的腫瘤標志物溶液滴加到電極表面，用于和抗體的特異性識別，室溫下孵化I h，超純水沖洗；
(6)繼續滴加4~6μ?檢測抗體孵化物一介孔二氧化硅-Au-Ab2溶液至電極表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一種pH釋放型免疫傳感器；
2.檢測抗體孵化物一介孔二氧化硅-Au-Ab2溶液的制備 (1)介孔二氧化硅的制備
將0.3?0.7 g的CTAB溶于200 mL的超純水中，加入1~2 mL、2.0 mol/L的NaOH，于80°C回流反應20 min，隨后加入1.5~3.0 mL的四乙氧基硅烷，繼續反應2 h生成白色沉淀，為了去除溶液中殘留的CTAB，得到的沉淀重新分散在1.5 mL、質量分數為37%的HCl和75~100mL的甲醇的混合液中，80°C下回流10~12 h，將混合物離心，經水和甲醇洗滌數次，35~45°C下真空干燥，制得介孔二氧化硅，粒徑大小為100 nm左右，孔徑大小為5 nm左右；
(2)縮醛鏈接器修飾的介孔二氧化硅MSN-Aetal的制備
將0.1-0.3 g的介孔二氧化硅分散于20 mL乙醇中，加入0.2~1 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，80°C回流反應12 h，混合物經離心、洗滌、45°C下真空干燥，得到氨基化的介孔二氧化硅；
將0.1~0.3 g氨基化的介孔二氧化硅加到10 mL的二甲基亞砜溶液中，隨后加入50-100 mg 丁二酸酐和50~100 mg三乙胺，40°C下反應48 h，得到的固體經乙醇洗滌，真空干燥得到羧基化的介孔二氧化硅；
分別將20~80 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC和10~30 mg的N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶于3 mL超純水中，加入50-100 mg羧基化的介孔二氧化硅，80-130 mg的3，9-雙(3-氨丙基)-2，4，8，10-四氧雜螺[5.5] ^^一烷，室溫下攪拌8 h，沉淀經洗滌干燥得到縮醛鏈接器修飾的介孔二氧化硅MSN-Aetal ;
(3)羧基功能化金Au-COOH的制備
將20 mL、1%的HAuCljP 0.5 mmol巰基琥?白酸分散于85 mL的去氧甲醇中，在攪拌下，將25 mL、0.2 mol/L的NaBH4S液滴加到上述溶液中，得到的深棕色沉淀經乙醇洗滌后，真空干燥，制得羧基功能化金Au-COOH ；
(4)檢測抗體標記物一介孔二氧化硅-Au的制備
將10~20 mg的縮醛鏈接器修飾的介孔二氧化硅MSN-Aetal加入到0.5~3mmol/L、lmL的硫堇水溶液中，室溫下攪拌12 h，加入4~10 mg的羧基功能化金Au_C00H、10 mg的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC和5 mg的N-羥基琥珀酰亞胺NHS，繼續攪拌8 h，混合物經離心洗滌直到上清液為無色后，將沉淀重新分散在I mL的超純水中，成功的將硫堇封裝在介孔二氧化娃-Au中，制得檢測抗體標記物介孔二氧化娃-Au ；
(5)檢測抗體孵化物一介孔二氧化硅-Au-Ab2溶液的制備
將I mL的檢測抗體標記物介孔二氧化娃-Au與I mL、10 μ g/mL的檢測抗體溶液混合后，在4°C的條件下孵化12 h，離心后，將沉淀重新分散在I mL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，保存在40C的冰箱中備用。
[0007]3.腫瘤標志物的檢測方法
(I)將權利要求1所制備的免疫傳感器浸泡在0.5 mL、pH=3.7的醋酸鹽緩沖溶液12
h ；
(2 )采用三電極體系，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為輔助電極，導電玻璃作為工作電極，采用微分脈沖伏安法對上述浸泡液進行掃描測試，將電壓設置為-0.4-0.6 V，記錄電流的變化，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替腫瘤標志物抗原標準溶液進行測試。
[0008]上述腫瘤標志物選自下列之一:CD146、AFP、CA153、CA125。
[0009]本發明的有益成果
(I)基底采用的是具有磁性的氨基化四氧化三鐵，可以很穩定的吸附在磁電極上，并且其具有良好的生物相容性和穩定性。
[0010](2)介孔二氧化硅具有大的比表面積、良好的吸附能力和生物相容性，有利于將大量的硫堇封裝在介孔二氧化硅-Au中，防止了硫堇的泄露，利用調節pH來對孔道的開關進行控制，提高了傳感器的靈敏度。
[0011](3)本發明制備的電化學免疫傳感器用于腫瘤標志物的檢測，響應時間短，檢測限低，線性范圍寬，可以實現簡單、快速、高靈敏和特異性檢測。
【具體實施方式】
[0012]實施例1一種pH釋放型免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉對磁電極進行拋光處理，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2-0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ；
(2)取6μ?、0.5 mg/mL的氨基化四氧化三鐵溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；
(3)滴加3μ?的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶液與N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶液的混合液到電極表面，再繼續滴加6 μ?、5 Pg/mL的腫瘤標志物捕獲抗體，4°C下晾干，超純水沖洗；
所述1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶液與N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶液的濃度均為0.1 mol/L，其體積比為1:1;
(4)用3PU質量分數為0.5%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，4°C下晾干，超純水沖洗；
(5)將6μ?的一系列不同濃度的腫瘤標志物溶液滴加到電極表面，用于和抗體的特異性識別，室溫下孵化I h，超純水沖洗；
(6)繼續滴加4μ?檢測抗體孵化物一介孔二氧化硅-Au-Ab2溶液至電極表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一種pH釋放型免疫傳感器；
實施例2—種pH釋放型免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉對磁電極進行拋光處理，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2-0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ；
(2)取6μ?、1 mg/mL的氨基化四氧化三鐵溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；
(3)滴加3μ?的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶液與N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶液