一種基于生物活性檢測的火麻仁質量控制評價方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及中藥質量控制評價，特別是一種基于生物活性檢測的火麻仁質量控制 評價方法。
【背景技術】
[0002] 當前中藥的質量控制方法是主要測定其所含的一種或兩種化學成分，所測定的化 學成分稱為指標性成分，通過對指標性成分的定性或定量測定以反應該中藥合格與否或評 價質量優劣。由于目前絕大多數中藥藥效物質不明確，所測定指標性成分并不能直接關聯 其藥效，所以對于這類中藥來說這種模式難以關聯或反映其臨床使用的安全性和有效性。 《中國藥典》2010年版編制大綱明確指出，要建立符合中醫藥特點的質量標準體系，逐步由 單一指標性成分定性定量向活性、有效成分及生物測定的綜合檢測過渡，向多成分及和指 紋或特征圖譜整體質量控制模式轉化。由此而制定的"中藥生物活性測定指導原則"已被 《中國藥典》（一部）2010年版附錄收載。
[0003] 對于成分復雜的中藥，《中國藥典》提倡建立與其功效相關的生物活性測定方法， 將生物活性測定法（又稱生物檢定bioassay)引入中藥質量控制和評價體系，對于成分多 樣、結構復雜、理化方法不能表征其含量、理化測定不能反映生物活性和療效的中藥能凸顯 其優越性。
[0004] 當前，一種新的研宄日益受到重視：很多疾病的發生發展與腸道菌群結構失調有 密切關系，許多中藥就是通過改善腸道菌群結構來發揮療效的。如近日研宄發現，中藥黃 連治療糖尿病機制是黃連中的小檗堿在穿過腸道時，可能會改善腸道菌群的結構，消滅 "有害菌"催生"有益菌"，減少內毒素入血，減輕慢性炎癥，從而達到治療或者預防糖尿 病等代謝疾病的目的。
[0005] 傳統中藥火麻仁（Semen Cannabis)為桑科植物大麻（Cannabis stativa L.)的干 燥成熟種子，具有潤腸通便，滋養補虛的功效，常用治療老年虛性便秘和習慣性便秘。據報 道，世界五大長壽地區之一，我國廣西巴馬瑤族自治縣百歲以上老人，其長壽原因除環境因 素之外，均有獨特的常年食用火麻仁油的生活習慣，他們的心血管疾病及老年性便秘的發 病率極小。同時，有研宄表明這些長壽老人腸道內的益生菌群比例比其他地區的要高。上 述研宄結果提示火麻仁可能是通過調整腸道菌群而有益于人體健康。雖然火麻仁為常用中 藥，但是當前尚缺乏相應的生物活性測定方法用于火麻仁質量控制評價。
【發明內容】
[0006] 針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種基于生物活 性檢測的火麻仁質量控制評價方法，可有效解決火麻仁質量控制評價的問題。
[0007] 本發明解決的技術方案是，由以下步驟實現：
[0008] (1)制備火麻仁供試藥物：
[0009] 火麻仁凈選去皮，115-125°C炒制13-17分鐘，榨油，得火麻仁油，即為火麻仁供試 藥物，密封于棕色玻璃瓶內，避光、4 °C保存備用；
[0010] ⑵制備梯度藥物培養基：
[0011] 稱取營養肉湯培養基16-20g，加入蒸餾水950-1050mL，攪拌加熱煮沸溶解成培養 基溶液，在培養基溶液中加入火麻仁供試藥物，制成火麻仁油體積濃度為12. 5%的液體培 養基，再進行倍比梯度稀釋，方法是，在火麻仁油體積濃度為12. 5%的液體培養基中加入同 體積培養基溶液（如ImL的火麻仁油體積濃度為12. 5 %的液體培養基再加入ImL的培養基 溶液），如此多次稀釋，共呈7個濃度梯度的含火麻仁油的梯度液體培養基，用0.1 M的HCL 分別調PH7. 20,120-125°C高壓滅菌15min，冷至常溫，備用；
[0012] ⑶細菌培養：
[0013] 分別取乳酸菌濃度為0. 5麥氏濁度的菌液20 μ L，接種于步驟（2)制備的7個濃度 梯度的含火麻仁油的梯度液體培養基中，35-39°C厭氧培養26-30小時；
[0014] 所述的乳酸菌為保加利亞乳桿菌、乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌的一種；
[0015] (4)菌液最大吸收波長篩查：
[0016] 采用分光光度計測定菌液中乳酸菌的相對數量和波長，取菌液200 μ L加入96孔 板，加3個復孔，用多個波段掃描，繪制吸光度與波長關系圖，確定最大吸收波長；
[0017] (5)梯度液體培養基中細菌相對數量的測定與比較：
[0018] 將每梯度濃度的梯度液體培養基菌液各取200 μ L加入96孔板，同時對應取含相 同濃度火麻仁油培養基各200 μ L加入96孔板作為背景扣除，然后將96孔板放入酶標儀， 調整至菌液最大吸收波長，振搖5秒，測吸光度OD差值；
[0019] 實驗組吸光度差值為X，對照吸光值差值Υ，即：
[0020] X =實驗組OD-背景OD ;Y =對照組OD-背景OD
[0021] E = X-Y ;Ε > 0,表示對細菌增值，E < 0表示對細菌無增值；
[0022] T = [(X-Y)/Y] X 100 %
[0023] T :促菌率或抑菌率，正值是促菌，負值為抑菌；
[0024] (6)效價測定與計算：
[0025] 選擇果寡糖為對照品，供試藥物效價測定步驟同步驟（1)-(5)，為效價計算方便， 根據預實驗與對供試藥物的效價估計，對供試藥物與對照品的加樣量要保證反應時促菌 率T在45-55%，并保證供試藥物與對照品反應的量效關系曲線平行；當對照品效價值為 10.0 U 根據平行線測定原理，依照2010版《中國藥典》二部附錄XIV生物檢定統計法 項下規定的量反應平行線測定法中的2. 2法，進行供試藥物與對照品效價的對比檢定，實 現對火麻仁質量控制評價；
[0026] 所述的火麻仁油劑量的線性量效范圍為0. 0075g · mL-1~0. 0625g · mL ―1，果聚糖 劑量的線性量效范圍為〇. 0030g · mL-1~0. 0120g · mL ―1，相關系數R > 98%。
[0027] 本發明首次建立以藥效為基礎的火麻仁質量生物測定技術，作為藥典常規和化學 測定的補充與提高，能夠從多重角度共同把關其內在質量，完善現行質量控制和評價方法 與標準，并能為其它藥效物質不明確的中藥質量控制與品質評價研宄提供新的技術途徑， 易操作，實用性強，應用面廣，是中藥質量控制和評價上的創新。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發明的火麻仁體外促進乳酸桿菌的研宄與測定的工藝路線圖。
[0029] 圖2為本發明的菌液最大吸收波長篩查的結果示意圖。
[0030] 圖3為本發明的不同培養液中細菌相對數量的測定與比較實驗的具體加樣設計 圖。
[0031] 圖4為本發明的不同培養液中細菌相對數量的測定與比較實驗的結果示意圖。
[0032] 圖5為本發明的供試品與工作對照品的量效關系曲線圖。
[0033] 圖6為本發明的16個批次的火麻仁樣品的促菌活性檢測結果的SPSS19. 0聚類分 析圖。
【具體實施方式】
[0034] 以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0035] 本發明在具體實施中，可由以下實施例給出。
[0036] 實施例1
[0037] 本發明在具體實施中，由以下步驟實現：
[0038] (1)制備火麻仁供試藥物：
[0039] 火麻仁凈選去皮，120°C炒制15分鐘，榨油，得火麻仁油，即為火麻仁供試藥物，密 封于棕色玻璃瓶內，避光、4°C保存備用；
[0040] ⑵制備梯度藥物培養基：
[0041] 稱取營養肉湯培養基18g，加入蒸餾水lOOOmL，攪拌加熱煮沸溶解成培養基溶液， 在培養基溶液中加入火麻仁供試藥物，制成火麻仁油體積濃度為12. 5%的液體培養基，再 進行倍比梯度稀釋，方法是，在火麻仁油體積濃度為12. 5%的液體培養基中加入同體積培 養基溶液（如ImL的火麻仁油體積濃度為12. 5 %的液體培養基再加入ImL的培養基溶液）， 如此多次稀釋，共呈7個濃度梯度的含火麻仁油的梯度液體培養基，用0.1 M的HCL分別調 pH7.20，121°C高壓滅菌15min，待冷至常溫，備用；
[0042] (3)細菌培養：
[0043] 分別取保加利亞乳桿菌濃度為0. 5麥氏濁度的菌液20