一種基于化學發光法檢測Lp-PLA2和CRP含量的試劑盒及方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫分析領域，具體地涉及一種基于化學發光法檢測LP-PLA2和CRP 含量的試劑盒及方法和應用。
【背景技術】
[0002] 缺血性腦卒中是臨床上的一種常見病、多發病，其常見的病因為動脈粥樣硬化導 致管腔狹窄和腦血栓形成，造成局部腦供血區血流中斷，發生腦組織缺血、缺氧、軟化壞死。 大量研宄標明動脈粥樣硬化本身是一個炎癥的過程，持續的低水平炎癥預示著心腦血管疾 病發生的可能性。Lp-PLA2為新近發現的炎癥標志物，屬于磷脂酶A2超家族中的非鈣離子 依賴型磷酸酯酶，主要由炎癥細胞（如巨噬細胞、淋巴細胞等）分泌，并受炎癥介質的調節。 CRP是由肝臟合成的一種全身性炎癥反應急性期的非特異性標志物，是心腦血管疾病最強 有力的預測因子之一，對心血管、腦血管以及外周血管疾病有著最好的預測及預后效果。
[0003] 有研宄表明，缺血性腦卒中發生后，患者LP-PLA2及CRP水平都明顯升高，其水平 隨神經功能缺損程度增加而呈遞增趨勢，差異有統計學意義。同時血清CRP水平對預測腦 梗死體積也具有重要意義。Lp-PLA2及CRP的同時檢測有助于更加全面地判斷腦梗的嚴重 程度并對其防治與預后提供實驗室參考。
[0004] 目前通過聯合檢測LP-PLA2與CRP兩個指標實現對缺血性腦卒中的診斷的檢測方 法主要有膠乳增強免疫比濁法、酶聯免疫吸附試驗（ELISA)等。膠乳增強免疫比濁法存在 檢測線性范圍窄、陽性率低等缺點；ELISA法存在靈敏度低、線性范圍窄、不易實現全自動 化等缺陷；從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。目前化學發光免 疫分析技術因其有上述諸多優點得到了廣泛的應用。
【發明內容】
[0005] 發明目的：本發明的目的是提供一種基于化學發光法的基于化學發光法檢測 Lp-PLA2和CRP含量的試劑盒，該檢測試劑盒的檢測具有簡便、快速、靈敏度高、線性范圍寬 和穩定性好等優點，可以有效地用于腦卒中發生后神經功能損傷程度和梗死體積評價。
[0006] 技術方案：為了解決上述技術問題，本發明提供了一種基于化學發光法的基于化 學發光法檢測Lp-PLA2和CRP含量的試劑盒，所述的試劑盒包括抗異硫氰酸熒光素多克隆 抗體包被的磁微粒、異硫氰酸熒光素標記的Lp-PLA2單克隆抗體、異硫氰酸熒光素標記的 CRP單克隆抗體、堿性磷酸酶標記的Lp-PLA2單克隆抗體、堿性磷酸酶標記的CRP單克隆抗 體和堿性磷酸酶催化發光的化學發光底物液、稀釋液、清洗液、Lp-PLA2系列校準品和CRP 系列校準品。本發明的試劑盒的反應試管的材料選自透明的聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中 的至少一種。
[0007] 其中，所述的抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒由羧基修飾的磁微粒 表面共價結合抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體制備得到，其中，所述的磁微粒粒徑為0. 7~ 1ym，內核為四氧化三鐵表面包裹有羧基基團。在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含 的雜質成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準確性，所以從復雜的待測樣品基質中 快速分離、純化出目的待測物是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測技術是 利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學偶聯等方法 包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質，具有分離速度快、效率高、可 重復性好、操作簡單、不影響被分離細胞或其他生物材料的生物學性狀和功能等特點，在外 加磁場作用下可定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。
[0008] 具體地，所述的抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒懸浮于所述稀釋液 中，配制成0. 5~2yg/mL的磁微粒溶液；所述異硫氰酸熒光素標記的LP-PLA2單克隆 抗體和異硫氰酸熒光素標記的CRP單克隆抗體溶解在所述稀釋液中，分別配制成0. 25~ 0. 5yg/mL異硫氰酸熒光素標記的Lp-PLA2單克隆抗體溶液和0. 25~0. 5yg/mL異硫氰酸 熒光素標記的CRP單克隆抗體溶液；所述的堿性磷酸酶標記的Lp-PLA2單克隆抗體和堿性 磷酸酶標記的CRP單克隆抗體溶解在所述稀釋液中，分別配制成0. 25~0. 5yg/mL堿性磷 酸酶標記的Lp-PLA2單克隆抗體溶液和堿性磷酸酶標記的CRP單克隆抗體溶液。
[0009] 優選地，所述的異硫氰酸熒光素標記的Lp-PLA2單克隆抗體溶液和異硫氰酸熒光 素標記的CRP單克隆抗體溶液通過透析法制備得到。
[0010] 優選地，所述的堿性磷酸酶標記的LP-PLA2單克隆抗體和堿性磷酸酶標記的CRP 單克隆抗體通過分別活化Lp-PLA2單克隆抗體、CRP單克隆抗體以及堿性磷酸酶溶液后，分 別將活化后的Lp-PLA2單克隆抗體和CRP單克隆抗體與活化后的堿性磷酸酶溶液混合后得 到。
[0011] 所述的化學發光底物液為〇. 1~〇. 3M、pH值為8~10的Tris-HCl緩沖液，所述 化學發光底物液含有〇. 2~0. 4mg/mL的二氧雜環乙烷。
[0012] 所述的稀釋液為0? 05~0? 5M、pH值為7. 0~8. 0的Tris-HCl緩沖液且所述稀釋 液含0. 4~0. 6wt%的牛血清白蛋白BSA和0. 05~0. 3wt%的疊氮化鈉；所述的清洗液為 0. 1~0. 2M、pH值為8~9的Tris-HCl緩沖液，所述Tris-HCl緩沖液含有0. 01~0. 04wt% 的吐溫20和15~20wt%的氯化鈉。
[0013] 所述的LP-PLA2系列校準品和CRP系列校準品的濃度范圍分別為0~50ng/mL和 0 ~100ng/mL〇
[0014] 本發明還提出了一種利用上述的試劑盒來檢測LP-PLA2和CRP含量的方法，其特 征在于，包括如下步驟：
[0015] (1)將試劑盒中的所有試劑取出后平衡到室溫；使用前將抗FITC多克隆抗體包 被的磁微粒溶液徹底混勻，確保磁微粒懸浮均勻；用去離子水將清洗液稀釋，混勻；設定好 37°C水浴；使化學發光檢測儀處于待測狀態；
[0016] (2)待測樣本或校準品、FITC標記的LP-PLA2單克隆抗體溶液和ALP標記的 Lp-PLA2單克隆抗體溶液混合溫育，同時將待測樣本或校準品、FITC標記的CRP單克隆 抗體溶液分別與和ALP標記的CRP單克隆抗體溶液混合溫育，用多管混勻器振蕩混勻，置 37 ±0. 5°C水浴，然后向各個試管中加入抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒溶液， 用多管混勻器振蕩混勻，置37±0.5°C水浴，試管連架放至磁分離器上，確保試管與磁板接 觸，沉淀；倒出上清液，然后加稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器振蕩混勻；重 復上述清洗操作，共清洗3次；
[0017] (3)加堿性磷酸酶催化發光的化學發光底物液至每一試管中，混勻，在5分鐘內用 發光檢測儀進行檢測，利用四參數邏輯擬合得到校準品劑量-反應曲線的回歸方程，再根 據待測樣本的相對發光強度可以從回歸曲線上返算出樣本中待測物的濃度。
[0018] 本發明進一步提出了上述試劑盒在制備用于腦卒中發生后神經功能損傷程度和 梗死體積評價的試劑上的應用。
[0019] 本發明提供的試劑盒的檢測原理如圖1所示，其中發光標記物1為異硫氰酸熒光 素，發光標記物2為堿性磷酸酶，將待測樣本、FITC標記的LP-PLA2單克隆抗體溶液和ALP 標記的Lp-PLA2單克隆抗體溶液混合溫育，同時將待測樣本、FITC標記的CRP單克隆抗體 溶液分別與和ALP標記的CRP單克隆抗體溶液混合溫育。然后加入包被有抗FITC多克隆 抗體的磁微粒，然后加入包被有抗FITC多克隆抗體的磁微粒，免疫復合物被吸附到磁微粒 表面。洗滌去除未結合的抗體和雜質后加入發光底物，ALP催化底物發光，測定相對發光強 度（RLU)。在一定范圍內RLU與Lp-PLA2與CRP抗原濃度呈正比，通過內插法就可以從標準 曲線上讀取待測樣本中的Lp-PLA2與CRP含量