高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及動物組織和排泄物的檢測領域,特別是一種高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法。
【背景技術】
[0002]樣品前處理是分析檢測過程的關鍵環節,是濃縮被測定的痕量組分,提高方法的靈敏度,及除去對分析系統有干擾的物質的重要手段。萃取是從樣品集體中分離出目標化合物的一項技術,是樣品預處理中最重要的方法之一。目前,液液萃取仍然是應用最廣泛的樣品制備方法之一,但是,傳統的液液萃取的操作繁瑣費時、有機溶劑消耗量大,而且容易出現乳化現象的缺陷,使得在實際應用中具有一定的局限性。
[0003]1998年,科學家提出了在傳統的液液萃取的基礎上,利用一種具有吸附性和較大的比表面積的惰性多空填料作為介質,建立的一種新型高效樣品的制備方法-介質液液萃取(supported liquid extract1n簡稱SLE),SLE萃取技術就是選用一種多孔性惰性材料-煅燒硅藻土作為介質,取代分液漏斗,增大了兩相接觸時的作用面積,實現高效、快速的萃取過程。
[0004]當水溶液樣品加樣到固定的聚丙烯注射管中的煅燒硅藻土上后,經過一定時間(一般分為幾分鐘),水相溶液以一層薄薄的液膜形式分布在填料表面,之后,將有機溶劑從柱管上端加入,當互不相溶的兩相在硅藻土表面接觸的同時萃取立即發生,最后萃取液在重力作用下流出,必要情況下,可以施加較小的壓力,而水相保留在介質中。盛接的流出液直接將溶劑吹干,復溶后,即可用于下一步分析檢測。
[0005]農業部1025號公告-11-2008公開了豬尿中β -受體激動劑多殘留檢測,其采用酶解后異丙醇-乙酸乙酯進行萃取,并通過內標法可以得到相關的檢測結果,但是在實際應用中,采用酶解后然后在采用傳統方法萃取后通過色譜檢測有時無法檢出殘留項。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種分離效率高、操作簡單的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法。
[0007]本發明的技術方案為:一種高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法,包括以下步驟:
[0008]步驟1:樣品預處理;收集豬尿,首先加入β -鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶進行酶解,酶解結束后加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質,加入4倍豬尿體積的Ph范圍為5.5?6的乙酸銨緩沖液,漩渦混合器混合后離心;取離心后的上清液;
[0009]步驟2:將上清液加入到SLE柱后,靜置2?4分鐘;
[0010]步驟3:采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫至少兩次,接收洗脫液,得到含有萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇的洗脫液;[0011 ] 步驟4:采用高效液相色譜法對步驟3得到的洗脫液進行檢測,所述的高效液相色譜法的具體參數為:
[0012]色譜柱:C18柱,150mm*3.9mmID
[0013]柱溫:室溫
[0014]流動相:0.05%磷酸水溶液和乙腈的混合液,其中0.05%磷酸水溶液和乙腈的體積比為100:12 ;
[0015]檢測器:UV檢測器;
[0016]檢測波長:217nm;
[0017]其中,所述的二元洗脫劑為正丁醇和乙酸甲酯的混合物,其中正丁醇和乙酸甲酯的重量比為4:1?5:1。
[0018]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中,所述的豬尿為1ml,緩沖溶液為4ml,步驟2中所取的上清液為0.5ml,所述的步驟3中,每次洗脫時所用的洗脫劑為0.5ml。
[0019]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中,每毫升的尿液中加入β -鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶12 μ Lo
[0020]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中,所述的三氯乙酸和豬尿的質量比為1:98?100。
[0021]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中,所述的步驟I中,漩渦混合器混合處理的時間為0.5?1.5分鐘。
[0022]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中,所述的步驟I中,所述的離心處理的具體操作為:將經混合處理的溶液在離心機中以9000?11000轉/分鐘的速度離心0.5?1.5分鐘。
[0023]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中,所述的SLE柱為奧秘山東科技有限公司生產的介質液液萃取SLE柱。
[0024]本發明的有益效果如下:
[0025]采用SLE法分離豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇,先進行酶解使蛋白質和萊克多巴胺分離,采用緩沖溶液進行混合,然后通過SLE柱分離出萊克多巴胺,萃取劑為正丁醇和乙酸甲酯,本發明的分離效率好、分離時間短,同時結合HPLC法測量萃取得到的洗脫液,能夠準確的測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇的含量。特別是本發明采用正丁醇和乙酸甲酯分離三種受體激動劑,可以保證其在色譜柱上有效出峰,相比于傳統的檢測方法,其檢出難度降低,檢測精度升高。
【具體實施方式】
[0026]下面結合【具體實施方式】,對本發明的技術方案作進一步的詳細說明,但不構成對本發明的任何限制。
[0027]實施例1
[0028]步驟1:取豬尿lg,首先加入12 μ L β -鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶進行酶解,酶解時間為3-4小時,酶解結束后加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質,加入4ml的Ph為5.6的乙酸銨緩沖液,漩渦混合器混合后離心;取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質量比為1:99。
[0029]步驟2:將上清液加入到SLE柱后,靜置3分鐘;
[0030]步驟3:采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫2次,接收洗脫液,得到含有萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇的洗脫液;每次消耗的洗脫劑為0.5ml,所述的二元洗脫劑為正丁醇和乙酸甲酯的混合物,異丙醇和乙酸甲酯的重量比為4:1。
[0031]實施例2
[0032]步驟1:取豬尿lg,首先加入12 μ L β -鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶進行酶解,酶解時間為3-4小時,酶解結束后加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質,加入4ml的Ph為5.8的乙酸銨緩沖液,漩渦混合器混合后離心;取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質量比為1:100。