一種利用生物元件檢測痕量二價銅離子的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及利用生物材料進行環境檢測領域，具體地說是一種利用生物元件檢測 痕量二價銅離子的方法。
【背景技術】
[0002] 銅是生物體必需的微量元素，缺乏或過多都將產生不良影響。對人體來說，過量的 銅會引起肝硬化、皮膚病以及神經紊亂等問題。對低等動物比如水生生物的毒性就更為嚴 重，會阻滯水體的自凈過程，使藍藻及其它一些水生微生物不能順利生長發育。隨著工農業 生產的快速發展，水體銅污染日趨嚴重。"三廢"的排放、含銅礦產的開采、、含銅殺菌劑的長 期大量使用和城市污泥的堆肥利用，使水體含銅量達到未污染水體的幾倍甚至幾十倍，遠 遠超出了水體環境接納銅的能力，威脅到生態系統的穩定和人類的安全。因此，污染水體的 中的二價銅離子也逐漸引起人們的重視。目前檢測二價銅離子的方法主要有原子吸收法， 比色法，熒光猝滅法，極譜儀法，電化學發光分析法，電修飾法。但是以上方法有的需要大型 儀器，有的需要專業人員，有的檢出限較高，有的反應試劑獲取困難。而本方法的二價銅離 子指示試劑為生物元件，可以直接從生物體中大量產生，并且純化步驟簡單，容易獲取、此 外該方法可以在室溫條件下快速進行，可以結合紫外燈實現污染水體中二價銅離子的快速 檢測。具有良好的應用前景。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種利用生物元件檢測痕量二價銅離子的方法。
[0004] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：
[0005] -種利用生物元件檢測痕量二價銅離子的方法，取緩沖液與熒光鐵載體溶液P在 水環境下于室溫下反應5-10min，所得反應液A，待用；再取緩沖液與熒光鐵載體溶液P在 待測樣品的環境下于室溫下反應5-10min，所得反應液B，待用；收集420nm-600nm波長范 圍內反應液A與反應液B的不同發射光譜，通過光譜計算出熒光猝滅率a，并將其依據標準 曲線計算樣品中二價銅離子的濃度；所述緩沖液為l_8〇mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液， pH7-8〇
[0006] 所述緩沖液為度為l-80mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液，pH7-8。
[0007] 所述熒光鐵載體溶液P獲取的具體步驟為：挑取銅綠假單胞菌的單菌落培養在培 養基YK中，于30°C下培養12h后，將菌液置于10mL離心管中離心吸取上清液；上清液為熒 光鐵載體粗產品，粗品經固相洗脫銅柱純化，獲得具有410nm熒光激發波長的熒光鐵載體 溶液P。
[0008] 將試劑B與熒光鐵載體粗產品混勻后在固相洗脫銅柱上靜置5-10分鐘后，經去離 子水沖洗去除試劑B，熒光鐵載體粗產品固定在吸附柱上，然后加入試劑C將熒光鐵載體洗 脫下來，收集洗脫液，純化的具有410nm熒光激發波長的熒光鐵載體溶液P。
[0009] 所述洗脫液為 0? 02MNa2HP04,0. 5MNaCl，0. 05MEDTA，pH7. 2 ;試劑B為：0? 02M Na2HP04,1MNaCl,pH7. 2 ;試劑C為：0? 02MNa2HP04,1MNH4C1，pH7. 2。
[0010] 所述培養基YK成分為 6-10gK2HP04,3-5gKH2P04，l-3g(NH4)S04,0.l-0.4gMgS04， 4_5g琥珀酸，去離子水定容到1L，調PH7.0,高溫高壓滅菌。
[0011] 標準曲線的獲取：
[0012] (1)二價銅離子母液的配制：將2. 497gCu2S04 ? 5H20在100ml容量瓶中用去離子 水定容。獲得〇. 1M母液。
[0013] (2)構建緩沖條件：將不同濃度梯度的的二價銅離子溶液與100y1D液混合，并 用去離子水將溶液總體積補足到980y1，充分混勻，最終二價銅離子的濃度為0yM, 0. 1y M，0? 2uM，0? 4uM，0? 6uM，0? 8uM，1uM，2uM，4uM，6uM，8uM，10uM，20uM，30uM，40u M，50uM，100uM。
[0014] (3)與熒光鐵載體溫浴：將步驟⑵獲得一系列的緩沖體系中分別加入20y1熒 光鐵載體溶液P并在室溫下反應5min。
[0015] (4)熒光儀測定：將步驟（3)所得不同液體用熒光儀進行測定，激發光為410nm， 收集420nm-600nm波長范圍內的發生光譜，并記錄460nm處的發射光強度。然后計算出焚 光猝滅率a(a= 1-1/%)。其中I為在不同濃度的二價銅離子條件下于460nm處的獲得 的發射光強度，1〇為在〇UM二價銅離子條件下于460nm處獲得的的發射光強度。以熒光猝 滅率a依據標準曲線計算樣品中二價銅離子的濃度。
[0016] (5)標準曲線的繪制：用origin對數據進行處理繪圖，獲得標準曲線。
[0017] 與現有技術相比，本發明的積極效果是：
[0018] 目前，測定痕量二價銅離子以ICP/MS為主，儀器昂貴，操作復雜，且需要專業人 員。現有的檢測二價銅離子化學檢測方法，一般來說反應試劑獲取步驟復雜，該反應的反 應試劑為生物材料，可以從生物中直接產生。因此步驟簡單，費用低廉。此外，本發明利用 二價銅離子與熒光鐵載體的配位反應對二價銅離子進行檢測，其可以在室溫條件下快速進 行，可以結合紫外燈實現污染水體中二價銅離子的快速檢測。具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明實施例提供的所用的熒光鐵載體的結構式。
[0020] 圖2為本發明實施例提供的熒光鐵載體的提純步驟圖。
[0021] 圖3為本發明實施例提供的利用熒光鐵載體對二價銅離子檢測的效果圖，圖中二 價銅離子的濃度分別為OnM, 10nM, 100nM，1yM, 10yM, 100yM。
[0022] 圖4為本發明實施例提供的濃度梯度二價銅離子溶液用該方法測定后獲得的標 準曲線。
[0023]圖5為在其他水溶離子的干擾下對銅離子進行檢測的特異性圖。其中銅離子的濃 度為10yM,其他金屬離子的濃度為100yM。
[0024] 圖6為本發明實施例提供的采用本發明方法檢測銅離子的流程圖示。
[0025] 具體實例方式
[0026] 本發明以細菌分泌的熒光鐵載體為反應材料。二價銅離子的存在可以猝滅熒光鐵 載體的熒光從而完成檢測。并通過本發明可以檢測到實際樣品中加標的二價銅離子。
[0027] 實施例1:自來水中二價銅離子的加標濃度測定。
[0028] (1)樣品的獲取：自來水取自煙臺市萊山區自來水系統。
[0029] (2)自來水的加標處理：將二價銅離子加入自來水至終濃度為0.5y M。
[0030] (3)將加標處理的自來水865y1與100y1D液充分混勻
[0031] (4)與熒光鐵載體溫浴：將步驟（3)所得液與溶液P在室溫下溫浴5min，獲得液體 F〇
[0032] (5)將去離子水880y1與100y1D液充分混勾，并與溶液P在室溫下溫浴5min， 獲得反應液E。
[0033] (6)二價銅離子濃度的計算：將步驟⑷與步驟（5)最終所得液體E，F用熒光儀 進行測定，激發光為410nm,收集420nm-600nm波長范圍內的發生光譜，并記錄460nm處的 發射光強度。然后計算出熒光猝滅率a(a= 1-1/%)。其中I為液體E在460nm處的發 射光強度，1〇為液體F在460nm處的發射光強度。以熒光猝滅率a依據標準曲線計算樣品 中二價銅離子的濃度（參見表1)。
[0034] (7)將以上步驟反復三次。
[0035] (8)最終該反法的測試結果為：5. 14±0. 27yM。
[0036] (9)用ICP/MS的方法對自來水中的二價銅離子進行檢測，結果為： 4. 92±0. 21yM。
[0037] 所述D液的配方為：濃度為10mM的HEPES緩沖液，pH7. 4。
[0038] 參見圖2所述熒光鐵載體溶液P獲取的具體步驟為：挑取銅綠假單胞菌的單菌落 培養在培養基YK中，于30°C下培養12h后，將菌液置于10mL離心管中離心吸取上清液； 上清液為熒光鐵載體粗產品，將試劑B與熒光鐵載體粗產品混勻后在固相洗脫銅柱上靜置 5-10分鐘后，經去離子水沖洗去除試劑B，熒光鐵載體粗產品固定在吸附柱上，然后加入試 劑C將熒光鐵載體洗脫下來，收集洗脫液，便為純化的熒光鐵載體（參見圖1)。
[0039]同時，熒光鐵載體溶液P的獲得可具體可參見文獻Yinetal.，2015.
[0040]Biosens.Bioelectron. 64, 81~87〇
[0041] 所述洗脫液為 0? 02MNa2HP04,0. 5MNaCl，0. 05MEDTA，pH7. 2 ;試劑B為：0? 02M Na2HP04,1MNaCl,pH7. 2 ;試劑C為：0? 02MNa2HP04,1MNH4C1，pH7. 2。
[0042] 所述培養基YK成分為 6gK2HP04, 3gKH2P04,lg(NH4)S04,0?lgMgS04,4g琥珀酸，去 離子水定容到1L，調PH7. 0,高溫高壓滅菌。
[0043] 標準曲線的獲取：
[0044] (1)二價銅離子母液的配制：將2. 497gCu2S04?5H20在100ml容量瓶中用去離子 水定容。獲得〇. 1M母液。
[0045] (2)構建緩沖條件：將不同濃度梯度的的二價銅離子溶液與100U1D液混合，并 用去