感性 相關的信息。基于第一分析期間鑒定的微生物的身份，可以對一種或多種特定蛋白質進行 第二分析（再分析）。這在附圖IA中用箭頭114表示，其顯示來自第一分析的信息用于指 導第二分析。
[0104] 基于圖IA的步驟104至112的事件序列所獲得的屬或種的鑒定，儀器軟件可以采 用儀器高級編程接口（InstrumentAdvancedProgrammingInterface) (IAPI)編碼的軟 件。IAPI軟件（ThermoFisherScientific)是數據獲取指導主控制程序，其可以對決定 邏輯進行編程，用于接下來的實時獲取步驟，同時對樣品進行分析，并且仍然可以隨時對分 析物進行進一步分析。該軟件是.NET兼容事件驅動軟件，其實際上沒有給分析增加開銷時 間。由于軟件系統具有非同步控制，多個"傾聽者"可以對單一事件或觸發進行響應。可以 采用任何種類的計算機語言，包括C編程語言，visualbasic和Python的所有演變，這里 僅僅例舉一小部分。例如，軟件用于驅動之前描述的分子量數據庫減少處理，并在數據獲取 期間執行。在該部分描述的方法用于觸發進行分型、毒力檢測和耐受性標記物鑒定的選擇 試驗。
[0105] 對于病原體大腸桿菌的例子，該軟件可以立即建立快速掃描，以檢測適當表達的 毒力、耐受性或分型標記物。對于大腸桿菌，其可以包括粘附性、侵入性、活動性/趨藥性、 毒力、抗吞噬蛋白質/分子，和抑制免疫反應涉及的蛋白質。可以采用本申請以下部分所述 的快速部分分離質譜（FPCS-MS)和目標串聯質譜對其進行監測。
[0106] I.固相提取
[0107] 參見圖IA的步驟116,從懷疑含有一種或多種微生物的樣品中提取出的可溶蛋白 質（與上述的用于鑒定目的的相同提取物，或者從相同樣品制備的另一提取物）經第二注 入，以進行第二固相提取（SPE)程序。
[0108] 再次參見圖3,對于第二SPE程序，系統300可以包括第二流路318,第二流路318 可用于將SPE盒320經流體管道322、第一開關閥326、第二開關閥328和電噴霧離子化 (ESI)噴霧器314與色譜柱324相連。上述的SPE盒320與圖IA的步驟104相關。首先， 采用例如100%甲醇或乙腈或其它溶劑的合適的組合，之后采用2%乙腈/0. 2%甲酸水溶 液（上樣緩沖液），對SPE盒320進行調節。接下來，將樣品上樣，采用基本相同的溶液，采 用反向流動通過SPE盒320。SPE盒320可以用2或更多床體積的上樣緩沖液或其它LC/MS 適用的緩沖液清洗，以除去鹽和其它污染物。
[0109] 清洗步驟之后，樣品可以從SPE盒中洗脫，其溶劑體積可以小至10納升或更少，或 十幾微升，以濃縮和優化完整蛋白質從而用于傳遞至色譜柱。之后SPE盒與色譜柱324流 體連接，對源自微生物細胞的完整蛋白質進行快速部分色譜分離。
[0110] II.快速部分色譜分離質譜分析（FPCS-MS)
[0111] 參照圖IA的步驟118,樣品經過部分色譜分離，之后進行質譜分析。通常，進行 FPCS-MS時，含有不同有機和無機分析物（小有機分子、蛋白質和其天然存在的片段、脂類、 核酸、多糖、脂蛋白質等）的復雜混合物的微生物細胞粗提物被上樣至色譜柱，進行色譜分 析。然而，與采用斜坡（gradient)分別洗脫每個分析物（理想地，每個色譜尖峰一個分析 物）相反，故意加速該斜坡至在大約8分鐘或更少、優選5分鐘或更少內基本沒有色譜尖 峰，而不是在長得多的、需要獲得基線分離的運行時間內。相反，根據它們的特性和采用的 色譜類型（反相，HILIC等），故意使許多分析物在任何給定時間從柱中共同洗脫。還可以 通過本領域技術人員知曉的其它方法執行部分或不完全分離，包括但不限于：采用流動相 溶劑和/或改性劑以減少化合物在柱上的保留，選擇固定相介質（包括粒徑、孔徑等）以減 少柱上化合物的保留，以較高流速運行色譜系統，以升高的溫度運行色譜系統，或選擇不同 的色譜分離模式（即反相、尺寸排阻等）。
[0112] 由于在整個斜坡上基本沒有色譜尖峰，關于混合物中的分析物的所有信息基本都 來自質譜。基本上，源自色譜圖的唯一相關信息是從柱中洗脫的時間。所記錄的每個質譜代 表接下來在質譜儀中離子化、分離并檢測的共同洗脫分析物子集。由于所有共同洗脫的分 析物同時離子化，它們受到混合物中離子化抑制的已知效應，該效應來自但不限于：（1)電 荷的競爭和（2)含量少的分析物的信號抑制。盡管離子化抑制效應對于許多質譜法來說通 常被認為是"不希望的"，但是在FPCS-MS中，這些效應有利于分析。然而，由于離子化抑制 的效應/含量多抑制含量少的效應，在質譜中記錄了來自數量顯著減少的蛋白質的信號。
[0113] 圖IIA-IIC圖示了在34攝氏度下，在Oxoid原裝胰酶大豆瓊脂上生長20小時的各 種微生物的FPCS-MA總離子電流圖譜。（A) -大腸桿菌ATCC8739; (B) -鵪鶉腸球菌ATCC700425 ; (C) -枯草芽孢桿菌斯皮茲仁亞種ATCC6633。關于樣品中分析物的總信息由整個 色譜實驗中從每個質譜提取的數據中收集，由此代表所有共洗脫的分析物"集"。由于幾乎 沒有色譜尖峰（例如，在5分鐘斜坡中3-5個寬尖峰，如圖11A-11C)，所有必需信息源自質 譜（m/z，強度），來自液相色譜（LC)的唯一信息是分析物"集"的共洗脫時間（如上所述， 由于離子化/分離效應，原始混合物組分中只有一些在質譜中表示出來）。
[0114] FPCS-MS要求無高流速的特殊柱、或小柱或非尋常形狀的柱（例如，V型柱），因此 通常稱為"彈道色譜"或"彈道斜坡"。FPCS-MS采用的柱可以是標準的色譜柱。例如，柱的 長度可以是20暈米、30暈米、50暈米、100暈米、150暈米、250暈米等，和/或這類柱的內徑 可以是2. 1毫米、1毫米、500微米、150微米、75微米等。粒徑和孔徑也可以是本領域標準 的。
[0115] FPCS-MS中采用的流速對于所采用的柱類型來說是標準的。例如，流速可以是900 微升/分鐘、400微升/分鐘、100微升/分鐘、30微升/分鐘、200納升/分鐘等。
[0116] 通過改變色譜條件（柱大小和化學性質、粒徑和孔徑、流動相和流動相改性劑）、 色譜類型、以及復雜樣品的離線分餾（其中單獨部分仍然留在復雜混合物中），可以關注原 始復雜混合物的非常不同的組分集。
[0117] 即使少至僅僅通過一個質譜儀掃描，共洗脫分析物的質譜也可以被記錄，因此，能 夠獲得的關于混合物中分析物的信息非常豐富，如圖12所示。
[0118] 結合起來看，采用靜電離子陷講（例如Q-Exactive、Exactive質譜儀（Thermo FisherScientific)或類似質譜儀的一部分）而得到的極高分辨率和質量準確性，為例如 毒力因子、耐抗生素和/或抗生素敏感性的生物標記物、株型的分化等的發現和目標分析 提供了強有力的工具。
[0119] 總體來說，FPCS-MS提供了快速分析，使設定時間期間內可分析的樣品數量達到最 大，同時提供了關于樣品的必要信息。
[0120] 在優選實施例中，對于采用的色譜柱，反相色譜分離中的流動相組合物以快得多 的方式前行，使得分子量差別很大的蛋白質一起從色譜柱中洗脫。
[0121] 色譜柱中的固定相可以是多孔或無孔二氧化硅、或瓊脂糖顆粒、或在柱內聚合或 其它方式形成的整塊材料。固定相可以涂覆有適當材料，例如c18、c8、c4或另一合適的衍生 物，以有利于蛋白質的分離，該材料可以化學結合至柱內的顆粒或整料。粒徑典型地是大約 1. 5至30微米。孔徑可以是50至300埃。柱內徑典型地是大約50微米至2. 1毫米，柱長 度是大約0. 5厘米至15厘米及以上。流動相或者洗脫劑可以是純溶劑，或兩種或多種溶劑 的混合物，可以含有添加的鹽、酸和/或其它化學改性劑。基于一種或多種物理化學屬性， 包括大小、凈電荷、疏水性、親合力或其它物理化學屬性，蛋白質在該柱上、或者兩個順序連 接或平行連接的柱上分離。色譜分離法包括一個或多個離子交換、尺寸排阻、疏水交互作 用、親合力、正相、反相或其它色譜法。
[0122] 在一個實施例中，反相色譜分離在50毫米X2. 1毫米內徑（ID)色譜柱上進行，其 內部填充1. 9微米的顆粒，孔徑是175埃（C18固定相），采用以下兩種流動相：流速是400 微升/分鐘的〇. 2%甲酸水溶液（流動相A)和0. 2%甲酸的乙腈溶液（流動相B)。在2、5 或8分鐘內，流動相B在流動相A中的斜坡是2-80 %，以此進行分離。
[0123] 為了適應快速分析和樣品周轉時間，在本發明的一個實施例中，以大于8分鐘或 更低來實現所述斜坡。該壓縮的斜坡模式使得分子量差別很大的蛋白質緊密地一起洗脫。 采用該實施例，可以檢測質量至70千道爾頓的蛋白質。該方法的一個顯著優勢在于，從較 大質量范圍得到改善的檢測特異性。基于ESI/MS方法的質量范圍顯著超過MALDI方法，其 實際上限是大約是12-15千道爾頓的質量，另外，通常在MALDI譜中觀察到的所有蛋白質均 在ESI/MS質譜中被發現。
[0124] 在其它實施例中，內徑0. 32毫米或更小并填充有(；固定相的色譜柱，采用位于流 動相A(具有0. 2 %甲酸的水）中、斜坡是20-60 %的流動相B(具有0. 2 %甲酸的乙腈），流 速大約是10微升/分鐘。色譜分離的斜坡洗脫時間可以是大約10分鐘至20分鐘，之后具 有短暫的再平衡時間，其通常小于分離時間。
[0125] III?離子化和質譜分析
[0126] 參見圖IA的步驟120,如本公開其它處詳細描述的，樣品可以離子化并接受質譜 分析。參見圖8A-8F，來自地衣芽孢桿菌、白假絲酵母菌、大腸桿菌、玫瑰考克氏菌、木糖葡 萄球菌和恥垢分枝桿菌的蛋白質提取物經上述FPCS-MS程序部分分離。在5厘米X2. 1毫 米內徑柱中進行分離，該柱中充填有HypersilGoldC18類柱，粒徑是1.9微米，孔徑是170 埃。溶劑A由100%水和0.2%甲酸組成，溶劑B由100%乙腈和0.2%甲酸組成。起始條 件是98 %A和2 %B，流速是400微升/分鐘，柱溫度是40攝氏度。采用與全掃描分析關聯 的前三個最強尖峰的數據依賴分析，來執行串聯質譜分析。經過MS/MS的物質被放置在動 態排阻表中20秒種。得到的串聯質譜被3. 0版本ProsightM軟件搜索。
[0127] 圖8A-8F所示的數據顯示了FPCS-MS對跨越不同微生物種屬的大范圍微生物起作 用。此外，應當認識到，本公開描述的FPCS-MS程序可以進行圖IA步驟116-122的第二分 析程序，與對于不同微生物采用特定斜坡以及在某些情況下采用特定流動相的程序相比， 其快得多。類似地，由于本公開所述的程序不依賴于對混合物組分的基線色譜分離，所以斜 坡可以進行得快得多（例如5分鐘vs. 30分鐘，或vs. 90分鐘）。本發明所描述方法缺乏基 線分離，當組分從柱中流出時被擠在一起，這實際上是一個優點。例如，如上所述，蛋白質子 集的被迫共同洗脫導致混合物的離子化被抑制。盡管離子抑制通常被認為是不利的，但是 在這里，由于在所記錄的質譜中，信號僅來自最能離子化和豐富的蛋白質，所以離子抑制具 有簡化從柱中流出的復雜混合物的離子譜的效果。
[0128] IV.株型分型
[0129] 如圖IA的步驟122所示，給定株型或血清型的特定蛋白質可以用于對單獨分離物 進行分型。微生物分離物內的變異通常是全基因的刪除和/或插入的結果。因此，不同株型 可能潛在地缺乏或獲得數百個株型特異性蛋白質，該變異可以提供獨特的差別分型系統。
[0130] 在一個例子中，采用本發明的方法對十二株型大腸桿菌進行分析。結合十二個菌 株型中每一個中的35. 4千道爾頓蛋白質的變異，本發明相對于使用常規MALDI法能夠檢測 更多數量、更高分子量的蛋白質并具有更好質量準確性的能力得到了測試。如表1所示，五 種不同形式的質量大約是35千道爾頓的蛋白質被檢測。
[0131]
【主權項】
1. 一種鑒定一種或多種微生物的方法，包括： a. 提供含有一種或多種微生物的樣品； b. 將所述樣品中的所述一種或多種微生物破碎，以提供流體提取物； c. 將所述流體提取物中的可溶蛋白質部分與不可溶蛋白質部分分離，制備所述可溶蛋 白質部分的溶液； d. 將所述可溶蛋白質部分的溶液的流體離子化，以形成一種或多種離子化蛋白質； e. 用質譜儀分析所述一種或多種離子化蛋白質，其中所述分析包括：
1. 在第一質譜分析步驟中，獲