一種基于雙納米金探針檢測標志物的蛋白芯片的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物傳感器檢測領域，特別涉及一種基于雙納米金探針檢測標志物的 蛋白芯片。
【背景技術】
[0002] 急性心肌梗死（AMI)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）的嚴重類型。 據世界衛生組織（2012)統計每年大約有1. 75億人死于心血管疾病，占全球非傳染性疾病 死亡人數的46%。AMI是目前全世界范圍內男女發病、致死的主要原因之一，早期診斷對病 人的分類管理和預后至關重要。目前對疑似急性冠脈綜合征（ACS)的初步評價主要是結 合病史、心電圖改變及生化指標測定。心電圖是一種簡單快捷的方法，但在AMI早期僅有 50% -60%患者顯示有特征性改變。人群中尤其是老年人或合并其他疾病如糖尿病、充血性 心力衰竭等由于ACS癥狀不典型造成誤診率、漏診率的現象時有發生。因此，心肌損傷標志 物在AMI早期診斷、監控、預后和危險分層方面發揮著基礎性的作用。
[0003] 為滿足疾病診斷需求、節省醫療成本，目前已研制出多種生物傳感 器檢測心肌損傷標志物，包括光電二極管芯片、熒光技術檢測、表面等離子體 共振等[Vittorini S.,Clerico A·, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine [J], 2008, 46(6), 748-763] , [Gobi K. V. , Tanaka H. , Shoyama Y. , Miura N. , Sensors and Actuators B:Chemical[J], 2005, 111, 562-571]、[Nakamura H. , Karube I. ,Analytical and bioanalytical chemistry [J], 2003, 377 (3) ,446-468]，而實驗室 診斷則主要依賴ECLIA。前三種方法檢測靈敏度高，但儀器設備復雜、光學組件昂貴、 所需條件嚴格，限制 了其應用推廣[Mohammed M.I·，Desmulliez M.P.Y·，Biosensors and Bioelectronics[J]，2014,61，478-484]、[Gul 0. , Calay E.,Sezerman U. , Basaga H. , Gurbuz Y. , Sensors and Actuators B: Chemical[J],2007, 125 (2), 581-588]> [Matveeva E.G. , Gryczynski Z.,Lakowicz J.R. , Journal of immunological methods [J]，2005, 302 (I)，26-35]。后者為目前臨床上檢測心肌標志物最常用的方法，該 體系需要精密的分析技術如基于脈沖式的伏安法以及電化學阻抗譜方能實現高靈敏檢測， 另外由于相鄰電極活化性能的干擾導致其無法對多種標志物進行聯合檢測[Han K.N.，Le T. H. , Pham X. H. , Huynh-Nguyen B. C. , Kim J. H. , Ko E. , Kwon Η. T. , Seong G. H. , Sensors and Actuators B:Chemical[J], 2015, 207, 470-476]〇
[0004] 納米金作為比色分析指標因獨特的光學特性、良好的化學穩定性、生物相容性、 無毒性等備受關注，其能夠與多肽、蛋白質、適配體、核酸、肽核酸（PNAs)等多種生物分子 共價或非共價結合，從而實現對目的成分的檢測[Zhu Z.，Ravelet C.，Perrier S.，Guieu V. ,Fiore E.，Peyrin E.，Analytical chemistry[J]，2012,84(16), 7203-7211]。然而比 色技術由于缺乏合適的信號放大策略靈敏度低限制了檢測微量蛋白的能力。近來Peyrin 等人[Liu J. , Wang C. , Jiang Y. , Hu Y. , Li J. , Yang S. , Huang C. Z. , Analytical ch emistry[J]，2013, 85(3)，1424-1430]用單鏈結合蛋白（SSB)作為小分子熒光偏振分 析的信號增強器，YANG 等人[Tabakman S. Μ·，Chen Ζ·，Casalongue H. S.，Wang Η·，Dai Η.，SmalI [J]，2011，7(4)，499-505]用石墨烯輔助信號放大提高ATP檢測靈敏度。這些方法 在帶來高靈敏度的同時加大了非特異蛋白質的吸附，使背景信號增強、假陽性率升高。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種基于雙納米金探針檢測標志物的蛋白芯 片，該芯片40min內可對多種蛋白進行高靈敏聯合檢測，敏感快捷、成本低、小型化、不需要 復雜的光學組件、所用樣本量極少，在生物醫學及化學分析等方面均有廣闊的應用前景。
[0006] 本發明的一種基于雙納米金探針檢測標志物的蛋白芯片，由含有捕獲抗體的蛋白 芯片、標記檢測抗體和DNA探針1的檢測探針以及標有DNA探針2的信號探針組成；其中， 所述捕獲抗體、檢測抗體為TnI、MY0、HFABP相應的捕獲抗體、檢測抗體，DNA探針1 (檢測探 針）的序列為 5' -SH-(CH2) 3TTTTTTTTTTGCACAGGAGCAACAG-3'，DNA 探針 2 (信號探針）的 序列為 5' -SH-(CH2)3TTTTTTTTTTCTGTTGCTCCTGTGC-3'。
[0007] 所述蛋白芯片的制備方法為：將cTnI、MY0、HFABP捕獲抗體及羊抗鼠 IgG抗體與蛋 白點樣液混合，通過芯片點樣儀點樣；點樣完畢后將芯片晾干，經微陣列穩定液處理固定， 干燥后真空包裝保存備用。
[0008] 所述檢測探針的制備方法為：取AuNPs，用K2CO3調整pH ;依次加入CTnI檢測抗體、 MYO檢測抗體、HFABP檢測抗體；恒溫振蕩，然后加入DNA探針1，充分混勻，離心、重懸，保存 備用。
[0009] 所述信號探針的制備方法為：取AuNPs，離心，取DNA探針2,加入去離子水重懸納 米金，靜置，加入PB和NaCl，充分混勻靜置；再加入PB/NaCl混合液離心，加入ro/NaCl混 合液重懸，保存備用。
[0010] 所述信號探針使用時的加入量為6 μ L。
[0011] 本發明構建的蛋白微陣列體系基納米技術與核酸雜交于一體，人工合成的寡核苷 酸鏈遵循嚴格的堿基互補配對原則，借助于納米金成核反應原理，將兩種納米金探針高效、 特異性的結合從而提高蛋白檢測的靈敏度。構建的放大體系與目前相關資料報道結果相 比，背景信號弱，反應時間短，檢測靈敏度升高1~2個數量級。同時操作所需設備簡單、成 本低、短時間內可同時對多種蛋白進行快速、高靈敏度檢測，為臨床疾病的診治和預后開辟 了新道路。
[0012] 有益效果
[0013] 本發明40min內可對多種蛋白進行高靈敏聯合檢測，其中肌鈣蛋白I (cTnl)檢測 限為10pg/mL，與臨床電化學發光法（ECLIA)靈敏度相當；肌紅蛋白（MYO)與新型脂肪酸結 合蛋白（HFABP)檢測限分別為640pg/mL和10pg/mL，與ECLIA及酶聯免疫吸附法（ELISA) 相比，靈敏度大大提高；敏感快捷、成本低、小型化、不需要復雜的光學組件、所用樣本量極 少，在生物醫學及化學分析等方面均有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明的檢測過程及原理圖；
[0015] 圖2為標記前后的吸收光譜；
[0016] 圖3為納米金探針標記的電泳表征結果；
[0017] 圖4為檢測探針㈧與信號探針⑶的加入量的優化結果；
[0018] 圖5為蛋白芯片信號放大前（上）和信號放大后（下）的結果；
[0019] 圖6為蛋白芯片檢測心肌損傷標志物的特異性；其中，A加入樣品為PBS，B加入樣 品為HFABP抗原標準品，C加入樣品為cTnl抗原標準品，D加入樣品為MYO抗原標準品；
[0020] 圖7為HFABP、cTnl、MYO抗原標準品的標準曲線。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0022] cTnl、MYO、HFABP相應捕獲抗體、檢測抗體及抗原購自Hytest公司；15nm膠體金 溶液（AuNPs)購自上海水源生物公司；4-嗎啉乙磺酸（MES)，三羥甲基氨基甲烷（Tris)，乙 二胺四乙酸（EDTA)，四氯金酸，聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，牛血清白蛋白（BSA)，Tween-20購自 Sigma-Aldrich 公司；微陣列穩定液（microarray stabilizer)購自 SurModics 公司；磷酸 鹽緩沖液（lOmmol/L PBS，pH7. 4)，PBST 洗液（lOmmol/L PBS，0. 05% Tween20, ρΗ7· 4);雜 交液（lmmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl);膠體金重懸液（0· lmmol/LPB, 2· 5%蔗糖，0· 4% BSA，0. 1% PVP，0. 3% Tween20, ρΗ7· 4);金染液（lOOmmol/L 四氯金酸， 30% H2O2, 25mmol/L MES)。配制以上溶液所需試劑 K2C03,NaCl，KCl，Na2HP04· 12H20，KH2P04， HCl，蔗糖購自上海凌峰化學試劑有限公司。實驗用水為MiIIi-Q超純水（18. 2ΜΩ/cm)，醛 基片購自上海百奧科技有限公司，Human HFABP ELISA試劑盒購自荷蘭Hycult biotech公 司，兩條互補DNA探針由TaKaRa公司合成。
[0023] 實施例1
[0024] (1)蛋白芯片的制備：將cTnI、MY0、HFABP捕獲抗體及羊抗鼠 IgG抗體（質控點） 與蛋白點樣液按體積比1:1混合，通過芯片點樣儀固定在醛基化修飾的玻片上，點樣間距 400 μ m，點樣直徑80 μ m，點樣量0· 5 μ L，每種蛋白重復點樣6次，共點樣3排。點樣完畢后 將芯片置于25°C 12h晾干，經微陣列穩定液處理固定，干燥后真空包裝4°C保存備用。
[0025] (2)檢測探針制備：取ImL 15nmAuNPs三管，用0· 2mol/L K2CO3調整pH分別為 8· 0、8· 0、8· 5 ;依次加入cTnl檢測抗體L