基于結合抑制點擊化學反應檢測小分子配體靶蛋白的熒光生物傳感方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測小分子配體靶蛋白的熒光生物傳感方法，特別涉及一種基于 結合抑制點擊化學反應檢測小分子配體靶蛋白的熒光生物傳感方法。
[0002] 發明背景 蛋白質作為生命有機體的基本組成部分和細胞功能的重要執行者，幾乎參與了所有的 生理和病理過程，而這些過程又往往涉及到蛋白質和小分子配體之間的相互作用。因此蛋 白質-小分子配體相互作用的相關研宄，特別是以此為基礎的小分子配體靶蛋白的分析檢 測具有十分重要的意義。它不僅有助于揭示蛋白質和小分子配體參與的復雜細胞通路機 制，而且可以為臨床診斷、新藥開發設計等提供必要的數據信息支持。傳統的小分子配體靶 蛋白的檢測技術主要包括毛細管電泳、蛋白質片斷互補測定、表面等離子共振和熒光各向 異性分析等。這些方法雖各有優勢，但同時也存在操作繁瑣、儀器設備昂貴、靈敏度不足等 缺陷。
[0003] 近年來，通過共價鍵合的方式將小分子與寡核苷酸DNA鏈相耦連發展出了一類新 型的小分子配體功能化的核酸探針，其既具備小分子配體高親和力和高特異性的靶蛋白結 合能力，又具有DNA分子良好的設計靈活型。利用這類新型核酸探針，若干種簡便快捷且靈 敏度高的小分子配體靶蛋白檢測新方法得以建立，進一步促進了相關領域的發展。但與此 同時，這些新方法往往依賴于核酸工具酶參與的末端保護機制，而工具酶的活性在血清等 復雜樣本中易受酸度、離子濃度和其他分子的影響或污染，這將嚴重阻礙相應方法在復雜 樣本中的實際應用。在此背景下，發明一種無需工具酶參與的簡單、靈敏的小分子配體靶蛋 白檢測新方法顯得尤為重要。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是，針對現有方法的不足，提出一種無需工具酶參與的 具有較高選擇性和靈敏度的檢測小分子配體靶蛋白的熒光生物傳感方法。該方法依賴于寡 核苷酸DNA鏈末端修飾的特定小分子配體與其靶蛋白的特異性分子識別以及結合抑制的 點擊化學反應，并借助由銅納米顆粒和石墨烯組成的熒光淬滅納米探針體系，實現對于目 標蛋白的熒光定量檢測。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用如下機理：設計兩條堿基完全互補的DNA單鏈Pl和 P2,其中Pl的5'末端含有疊氮（azide)基團，P2的3'末端修飾有特定小分子配體；在室 溫條件下，Pl和P2在溶液中雜交形成雙鏈，成為具有熒光發射特性的銅納米顆粒合成的 模板。另外設計一條3'末端進行炔基（alkyne)功能化的DNA單鏈P3,其可以在亞銅離子 (Cu+)存在的條件下通過末端炔基與疊氮基團間的偶極環加成"點擊化學"反應實現與Pl鏈 的連接，形成具有單鏈分支的P1-P2-P3復合DNA結構；此時，若向檢測體系中引入氧化石墨 烯，上述DNA復合結構由于單鏈分支與氧化石墨烯之間的相互作用而被穩定吸附到氧化石 墨烯表面，最終導致以P1-P2雙鏈為模板合成的銅納米顆粒的熒光被顯著淬滅。另一方面， 當檢測體系中存在小分子配體靶蛋白時，靶蛋白可以通過與小分子配體間的高親和力和特 異性的分子識別過程而連接到P2鏈末端，形成蛋白結合的P1-P2雙鏈。這種情況下，由于 蛋白結合所形成的巨大位阻效應，Pl和P3鏈末端的疊氮和炔基基團無法彼此靠近，從而抑 制了點擊化學反應的發生；此時，若向檢測體系中引入氧化石墨烯，只有游離的P3單鏈被 吸附至氧化石墨烯表面，而P1-P2雙鏈遠離氧化石墨烯，從而使以其為模板形成的銅納米 顆粒的熒光得以較好地保持。基于以上過程，我們就可以通過分析最終反應體系中銅納米 顆粒的熒光強度，實現對小分子配體靶蛋白的定量檢測。
[0006] 根據上述機理，本發明采用的技術方案： 一種基于結合抑制點擊化學反應檢測小分子配體靶蛋白的熒光生物傳感方法，其特征 在于該方法的具體步驟為： (a) 設計并合成三條末端分別修飾疊氮基團（Azide)、小分子配體和炔基基團 (Alkyne)的寡核苷酸DNA單鏈；其中，修飾有疊氮基團的寡核苷酸DNA單鏈Pl的序列為： 5' -Azide-GAAGTCATGAGCGTATGAGTA-3'，修飾有小分子配體的寡核苷酸DNA單鏈P2的序列 為：5' -TACTCATACGCTCATGACTTC-小分子配體-3'，修飾有炔基基團的寡核苷酸DNA單鏈P3 的序列為：5'-CGATCCAGGTCATGC-Alkyne-3' ； (b) 單鏈Pl和單鏈P2互補雜交形成DNA雙鏈，且雜交形成雙鏈后疊氮基團和小分子配 體位于雙鏈的同一側末端；具體步驟為：將單鏈Pl和單鏈P2按1:1的摩爾比混合于MOPS 緩沖溶液中，攪拌均勻后在20~30 °C條件反應2~3小時，以使Pl和P2鏈互補雜交形成雙 鏈； (c) 將含有待測的小分子配體靶蛋白的樣品溶液加入步驟（b)所得的P1-P2雙鏈溶液 中，通過靶蛋白與小分子配體間的特異性分子識別，形成靶蛋白結合的P1-P2雙鏈；識別結 合反應時間為1~2小時，反應溫度為30~40 °C ; (d) 向步驟（c)所得反應體系中加入單鏈P3, P3鏈和P1-P2雙鏈的摩爾比為1:1)，再 加入還原劑抗壞血酸，混合均勻后加入含有二價銅離子的MOPS緩沖溶液，以進行點擊化學 反應并合成銅納米顆粒；反應所用時間為20~40分鐘，溫度為20~30 °C ;所述的P3鏈和抗 壞血酸的摩爾比為1 : 2000~3000，P3鏈和二價銅離子的摩爾比為1 : 200~300; (e) 向步驟（d)所得反應體系中加入氧化石墨稀，使反應體系中氧化石墨稀和P3鏈的 終濃度比為25~50 ug/mL :1 uM ;混勻后在20~30 °C條件下反應20~40分鐘以進行熒光淬 滅；反應結束后，使用熒光光譜儀記錄反應體系最終的熒光圖譜，并根據熒光發射強度實現 對小分子配體靶蛋白的定性定量檢測。
[0007] 步驟（a)中所使用的Pl和P2鏈的堿基序列并非已知序列，而是根據本發明的技 術原理隨機設計而成。其基本原則是兩者堿基完全互補，且在實驗過程中能夠保持穩定的 雙鏈結構，以作為銅納米顆粒合成的模板。同時考慮到長鏈DNA不易合成且成本較高，因此 Pl和P2鏈的最優序列長度為15~35 bp。一旦Pl和P2鏈的序列被設計出來，其合成將交 由專業的核酸合成公司完成。
[0008] 步驟（c)中所使用的P3鏈的序列同樣是隨機設計而成，其基本設計原則是：首先， 為了在維持低合成成本的同時保證P3鏈與氧化石墨烯之間有效的相互作用，序列長度應 為12~20 bp ;其次，為了避免P3鏈成為銅納米顆粒合成的模板，序列中不應存在多個連續 的胸腺嘧啶堿基。
[0009] 在步驟（c)中，二價銅離子在溶液中被抗壞血酸還原成Cu+，后者一方面發生歧化 反應生成零價銅原子，進而在P1-P2雙鏈的大溝位置發生富集并最終生成銅納米顆粒；另 一方面可以催化Pl和P3鏈末端的疊氮和炔基基團間的偶極環加成"點擊化學"反應，形成 具有單鏈分支的P1-P2-P3復合DNA結構。
[0010] 步驟（e)中所使用的熒光光譜儀為日立F-7000 Fluorescence Spectrophotometer，激發波長為340 nm，發射波長掃描范圍為500~670 nm。
[0011] 本發明建立的檢測小分子配體靶蛋白的熒光生物傳感方法，利用所發現的結合抑 制點擊化學反應，將寡核苷酸DNA鏈末端修飾的特定小分子配體與靶蛋白之間的分子識別 作用與"銅納米顆粒-石墨烯"熒光淬滅納米探針體系相偶聯，實現了小分子配體靶蛋白的 定量檢測。該方法靈敏度高，特異性強，同時無需蛋白酶參與，操作快速簡便，因而在臨床診 斷、藥物研發等領域具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發明建立的檢測小分子配體靶蛋白的熒光生物傳感方法的原理示意圖。
[0013] 圖2為未發生（A)或發生（B)點擊化學反應的實驗體系在氧化石墨烯淬滅40分鐘 前后的熒光光譜。
[0014] 圖3為檢測8.0 nM葉酸受體及對照實驗中所得到的熒光圖譜。（a)實驗組，體系 中含有8.0 nM葉酸受體；（b)對照組，體系中不含葉酸受體；（c)對照組，體系中含有1 μΜ 血紅蛋白。
[0015] 圖4為檢測不同濃度葉酸受體(從下至上分別為0 nM、0. 2 nM、0. 4 nM、0. 8 ηΜ、1. 6 ηΜ、3. 2 ηΜ、4. 8 nM、6. 4 ηΜ和8. 0 ηΜ)時得到的熒光圖譜。
[0016] 圖5為最終檢測體系中銅納米顆粒在598 nm處的熒光發射強度F598值與葉酸受 體濃度間的關系，插入圖為葉酸受體濃度在〇. 2-6. 4 nM范圍內，F598值與葉酸受體濃度之間 的線性關系。
[0017] 圖6為檢測（a)0 nM、（b)4 n