基于圖像分析的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測裝置及方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種高通量同時檢測貝類腹瀉性毒素的檢測裝置及技術，尤其涉及基 于圖像分析的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測裝置及方法。
【背景技術】
[0002] 貝類腹瀉性毒素是貝類從浮游藻類中聚集的有害有機物質存于體內蓄積而成，是 一類毒性很強的非蛋白毒素，食用后能使人中毒，甚至死亡。目前國內貝類腹瀉性毒素檢測 方法通常使用方法是小鼠生物檢測法，液相色譜質譜聯用方法和傳統的Elisa試劑盒檢測 方法。小鼠生物檢測法個體差異性大導致毒性難以估計，液相色譜質譜聯用方法操作繁瑣 并且設備龐大，無法適應現場檢測要求。傳統的Elisa試劑盒檢測方法所采用的檢測儀器 為酶標儀，依舊存在著設備龐大而無法適應現場檢測，并且酶聯反應隨著孵化時間的不同 存在差異，酶標儀采用的分時檢測的方式便造成了孔間檢測結果的差異。因此，海洋水產品 毒素檢測領域迫切需要一種能夠適應現場快速檢測、操作簡便并且檢測成本低廉的貝類腹 瀉性毒素檢測裝置及方法。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種基于圖像分析的貝類腹瀉性毒 素的高通量檢測裝置及方法。
[0004] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種基于圖像分析的貝類腹瀉性毒 素的高通量檢測裝置，該裝置包括：電源適配器、廣角鏡頭、智能移動設備、第一暗室、第二 暗室、商用試劑盒96孔檢測板、96孔檢測板裝載臺和冷光片；其中，第二暗室通過隔板分為 放置電源適配器的空間和檢測空間；所述檢測空間中具有可抽拉的96孔檢測板裝載臺，商 用試劑盒96孔檢測板通過卡槽固定在96孔檢測板裝載臺頂部，冷光片通過卡槽固定在96 孔檢測板裝載臺底部；電源適配器和冷光片連接；第一暗室通過透光隔板連接第二暗室的 檢測空間；在第一暗室的頂部開有圓孔，廣角鏡頭固定第一暗室頂部的圓孔正下方；智能 移動設備通過卡槽固定在第一暗室頂部外側，且其攝像頭可通過第一暗室的圓孔透過廣角 鏡頭，對第二暗室內的商用試劑盒96孔檢測板進行圖像采集。
[0005] -種基于圖像分析的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測方法，該方法包括以下步驟： (1)樣品前處理，制備貝類腹瀉性毒素待測樣品溶液，包括以下子步驟： (1. 1)取貝類生物，除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質器均質； (1.2)稱取I g均質后的樣品加入6 ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，得到混合溶 液； (1. 3)在4 °C下，將步驟1. 2得到的混合溶液以3500 r/min離心10分鐘，收集上清 液； (1. 4 )在步驟（1. 3 )殘留的貝肉組織中加2 ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，在4 °C 下，以3500 r/min離心10分鐘，收集上清液，加入到步驟（1. 3)收集的上清液中； (I. 5)重復步驟（I. 4)，待收集的上清液達到10 ml時，用0. 45 um的濾膜過濾，得到濾 液； (1.6)取20ul濾液，用樣品稀釋緩沖液PBS稀釋到I ml，然后取100 ul作為待測樣品 溶液； (2) 使用商用試劑盒96孔檢測板進行檢測，具體包括以下子步驟： (2. 1)將 HRP 酶標記物，OA 抗體溶液及 0 ppb、0. 2 ppb、0. 5 ppb、l ppb、2 ppb、5 ppb 的貝類腹瀉性毒素標準品置于室溫20-28 °C下，從鋁箔袋中取出微孔條； (2.2)分別取100 111的濃度為0口口13,0.2口口13,0.5口口13，1口口13,2口口13,5口口13的標準品 依次加到微孔條的微孔中； (2. 3)將步驟（1)得到的待測樣品溶液加到微孔條的其余微孔中； (2. 4)吸取50 ulHRP酶標記物到微孔條的每個微孔中，然后加入50 UlOA抗體溶液到 每個微孔中，混勻，在20-28 °C下孵育60分鐘； (2. 5)孵育完后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板緩沖液清洗，每個微孔至 少加入250 ul洗板緩沖液，震蕩后倒掉并倒置在吸水紙上拍打，重復三至四次；所述洗板 緩沖液為含有質量濃度為〇. 05%的Tween-20的PBS溶液； (2. 6)在每個微孔中加入100 ul底物溶液，在20-28 °C下避光孵育30分鐘，此時準備 好商用試劑盒96孔檢測板；所述底物溶液為TMB溶液； (3) 確定商用試劑盒檢測貝類腹瀉性毒素的標定曲線：將步驟（2)中準備好的商用試 劑盒96孔檢測板放置在96孔檢測板裝載臺上，96孔檢測板裝載臺推入第二暗室，然后智能 移動設備采集商用試劑盒96孔檢測板的圖像進行檢測，對采集的圖像進行處理，處理過程 包括以下子步驟： (3.1)切割出96孔檢測板上的微孔所對應的子圖像，子圖像的孔內像素范圍為 10X10 ； (3. 2)將子圖像轉換至顏色孔間RGB，提取子圖像中每個像素的R分量，并計算子圖像 像素R分量平均值； (3. 3)計算標準品溶液顏色比率CR，根據公式CR二（255 Ck) / (25 5 - C0)，其中，Ck 為0.2 ppb，0.5 ppb，l ppb，2 ppb，5 ppb的標準品孔的子圖像R分量平均值，Ctl為0 ppb 的標準品孔的子圖像R分量平均值； (3. 4)根據最小二乘法擬合曲線算法，擬合出顏色比率CR關于標準品濃度以10為底的 對數的標定曲線，即商用試劑盒檢測貝類腹瀉性毒素的標定曲線； (4) 檢測未知濃度的樣品溶液貝類腹瀉性毒素濃度：將步驟（1)得到的待測樣品溶液 加入到商用試劑盒96孔檢測板的微孔中，重復步驟（2. 4)-步驟（3. 2)，得到在該待測樣品 溶液濃度下的子圖像的R分量平均值，然后根據步驟（3. 3)的公式計算待測樣品溶液的CR 值，帶入步驟（3. 4)得到的商用試劑盒檢測貝類腹瀉性毒素的標定曲線，計算出待測樣品溶 液貝類腹瀉性毒素的濃度，根據步驟（1)的稀釋倍數，即可得到I ml待測樣品溶液的貝類 腹瀉性毒素。
[0006] 本發明的有益效果是：本發明實現了貝類腹瀉性毒素現場快速檢測，具有快速、同 步、操作簡便、成本低廉和能夠適應現場檢測等優點。本發明較現有的貝類腹瀉性毒素檢測 方法上，具有操作步驟簡單，成本低廉，高通量同時快速檢測等優點，克服現有方法無法現 場檢測的不足。根據以上優點，本發明的裝置及方法可廣泛用于海洋水產品毒素檢測的相 關領域。
【附圖說明】
[0007] 圖1是本發明貝類腹瀉性毒素的高通量檢測裝置整體結構圖； 圖2是本發明所使用的商用試劑盒96孔檢測板結構圖； 圖3是本發明檢測貝類腹瀉性毒素算法流程圖； 圖4是本發明與酶標儀檢測貝類腹瀉性毒素標定結果對比圖； 圖中，電源適配器1、廣角鏡頭2、智能移動設備3、暗室頂部4、暗室底座5、商用試劑盒 96孔檢測板6、96孔檢測板裝載臺7、冷光片8。
【具體實施方式】
[0008] 以下結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細描述，但并不是限制本發明。
[0009] 如圖1、2所示，本發明基于圖像分析的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測裝置，包括： 電源適配器1、廣角鏡頭2、智能移動設備3、第一暗室4、第二暗室5、商用試劑盒96孔檢測 板6、96孔檢測板裝載臺7和冷光片8 ;其中，第二暗室5通過隔板分為放置電源適配器1的 空間和檢測空間；所述檢測空間中具有可抽拉的96孔檢測板裝載臺7,商用試劑盒96孔檢 測板6通過卡槽固定在96孔檢測板裝載臺7頂部，冷光片8通過卡槽固定在96孔檢測板 裝載臺7底部；電源適配器1和冷光片8連接；第一暗室4通過透光隔板連接第二暗室的檢 測空間；在第一暗室4的頂部開有圓孔，廣角鏡頭2固定第一暗室4頂部的圓孔正下方；智 能移動設備3通過卡槽固定在第一暗室4頂部外側，且其攝像頭可通過第一暗室4的圓孔 透過廣角鏡頭2,對第二暗室5內的試劑盒96孔檢測板6進行圖像采集。
[0010] 一種應用上述裝置檢測貝類腹瀉性毒素的方法，包括以下步驟： (1) 樣品前處理，制備貝類腹瀉性毒素待測樣品溶液，包括以下子步驟： (1. 1)取貝類生物，除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質器均質； (1.2) 稱取I g均質后的樣品加入6 ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，得到混合溶 液； (1. 3)在4 °C下，將步驟（1. 2)得到的混合溶液以3500 r/min離心10分鐘，收集上清 液； (1. 4 )在步驟（1. 3 )殘留的貝肉組織中加2 ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，在4 °C 下，以3500 r/min離心10分鐘，收集上清液，加入到步驟（1. 3)收集的上清液中； (1. 5)重復步驟（1. 4)，待收集的上清液達到10 ml時，用0. 45 um的濾膜過濾，得到濾 液； (1.6)取20ul濾液，用樣品稀釋緩沖液PBS稀釋到I ml，然后取100 ul作為待測樣品 溶液； (2) 使用商用試劑盒96孔檢測板6進行檢測，具體包括以下子步驟： (2. 1)將 HRP 酶標記物，OA 抗體溶液及 0 ppb、0. 2 ppb、0