一種測定反硝化聯合厭氧甲烷氧化速率的方法
【技術領域】
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[0001]本發明屬于環境研宄領域，涉及運用同位素示蹤技術測定土壤、沉積物或活性污泥的反硝化聯合厭氧甲烷氧化速率的方法。
【背景技術】
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[0002]反硝化聯合厭氧甲燒氧化(nitrite-dependentanaerobic methane oxidat1n，n-damo)是指在厭氧條件下，N02_和NO 3_作為的電子受體被還原，甲烷作為電子供體被氧化氧化，最終生成隊和0)2的過程。自從2006年該過程首次在生物反應器中被發現以來，引起了人們的廣泛關注。稻田和濕地等自然生態系統是全球重要的甲烷源，反硝化聯合厭氧甲烷氧化過程可在厭氧條件下將CH4這一強力溫室氣體氧化成溫室效應較低的CO2，在全球變暖中具有重要科學意義。此外，在廢水處理領域尤其是對低C/N廢水脫氮處理中，反硝化聯合厭氧甲烷氧化過程可以利用厭氧段無法完全回收的甲烷對廢水進行脫氮處理，實現了甲烷的資源化利用，具有廣泛的應用前途。傳統對于反硝化聯合厭氧甲烷氧化的研宄集中在運用分子生物學方法研宄其在自然界中的存在和在生物反應器中的富集應用上，都無法準確定量評估反硝化聯合厭氧甲烷氧化反應的活性及其在自然界碳循環和廢水處理中的重要意義。
[0003]本發明正是針對上述問題開發的一種運用同位素示蹤技術測定土壤、沉積物和污泥的反硝化聯合厭氧甲烷氧化速率的方法。
【發明內容】
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[0004]針對上述問題，本發明的目的是提供一種運用130014同位素示蹤技術，進行土壤、沉積物或污泥實驗室模擬培養，測定培養體系中生成的450)2物質的量，來計算土壤、沉積物或活性污泥的反硝化聯合厭氧甲烷氧化速率。
[0005]本發明采用的主要技術方案為:將土壤、沉積物或活性污泥分別與土壤孔隙水、沉積物上覆水或活性污泥反應器污水在分裝之前混勻，同時通過高純氦氣的曝氣作用，盡量減少混合物分裝過程與空氣中氧氣的接觸。混合物分裝到玻璃進樣瓶后用高純氦氣曝氣30min，以吹脫混合物和玻璃進樣瓶頂空中的氧氣，創造厭氧環境。然后將分裝有混合物的玻璃進樣瓶置于黑暗中的恒溫振蕩器內，經過48h的預培養，消耗混合物及玻璃瓶上部頂空中殘留的NOpNO3-和O 2。預培養結束后，向玻璃進樣瓶中注入事先用高純氦氣曝氣的無02和CO 2的100 μ I 500mg L 4NaNO3-N和0.2ml 13C-CH4 (豐度為99% ),再次放入恒溫振蕩器內在相同的條件下計時培養。分別于Oh、24h、48h、72h和96h各取出三個玻璃進樣瓶，樣品暫時保存于4°C的冰箱中待上機測試。分別用穩定同位素比質譜儀和氣相色譜儀測定玻璃瓶上部空間氣體中450)2占總0)2的百分含量和總CO2的濃度，計算各個瓶內45CO2物質的量。將各個時間節點45CO2物質的量對時間回歸，計算出反硝化聯合厭氧甲烷氧化速率。
[0006]本發明的優點及效果是，設備簡單，操作方便，不需要在厭氧箱中操作即可創造嚴格的厭氧環境。用同位素標記反應底物，通過測定標記的產物計算反硝化聯合厭氧甲烷氧化速率，不受其他物理化學變化干擾。
【附圖說明】
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[0007]圖1為混合、分裝樣品示意圖。
[0008]圖2為創造厭氧環境示意圖。
[0009]圖1中:1-高純氦氣鋼瓶，2-分壓閥，3-硅膠管，4-3cm長塑料管，5-2cm長塑料管，6-血清瓶瓶蓋，7-血清瓶，8- 土壤、沉積物或活性污泥與原位水混合物，9-微型曝氣頭，
10-磁力攪拌器轉子，11-磁力攪拌器
[0010]圖2中:12-Labco玻璃進樣瓶，13-丁基橡膠墊，14-加長7號麻醉針針頭，15-lml注射器針頭，16-進樣瓶瓶蓋，17-上部頂空
【具體實施方式】
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[0011]本發明的【具體實施方式】:
1.混合、分裝樣品:稱取80g土壤、沉積物或活性污泥和160g 土壤孔隙水、沉積物上覆水或活性污泥反應器污水于500ml血清瓶(7)中，再放入一枚磁力攪拌器轉子(10)。血清瓶瓶蓋(6)用電鉆鉆有兩個直徑為5mm的孔，孔中塞入兩根長度分別為3cm和2cm外徑均為5mm的塑料管，并用萬能膠與血清瓶瓶蓋(6)膠連密封。其中3cm長塑料管(4)靠近血清瓶(7)內部一端用硅膠管(3)與微型曝氣頭(9)連接，另外一端用硅膠管(3)與高純氦氣鋼瓶⑴分壓閥⑵出口連接。2cm長塑料管(5)作為曝氣排氣口。蓋上血清瓶瓶蓋(6)，將血清瓶(7)置于磁力攪拌器(11)(型號:85-2A數顯測速恒溫磁力攪拌器)上，調節轉速為200rpm，打開高純氦氣分壓閥(2)調節壓力為0.05Mpa左右。待土壤、沉積物或活性污泥與原位水混勻后，停止曝氣打開血清瓶(7)，用移液槍小心轉移5ml 土壤、沉積物或活性污泥與原位水混合物至30個12ml Labco玻璃進樣瓶(12)。其中15個進樣瓶為實驗組，另外15個為陰性對照組。
2.創造厭氧環境:旋緊Labco玻璃進樣瓶瓶蓋(16)，用12cm加長7號麻醉針針頭(14)刺穿瓶蓋的丁基橡膠墊(13)至瓶底，加長7號麻醉針針頭(14)用硅膠管(3)連接高純氦氣鋼瓶(I)分壓閥(2)出口，再刺入一個Iml注射器針頭(15)作為曝氣排氣口。打開高純氦氣分壓閥(2)調節壓力為0.05Mpa左右，曝高純氦氣30min使Labco玻璃進樣瓶(12)內混合物(8)和上部頂空(17)達到厭氧環境，同時拔出Iml注射器針頭(15)和加長7號麻醉針針頭(14)。
3.預培養:將Labco玻璃進樣瓶(12)置于黑暗中的恒溫振蕩器(型號:HZQ_7恒溫振蕩器)內，調節溫度為30°C轉速為200rpm預培養48h以消耗混合物(8)及Labco玻璃進樣瓶(12)上部頂空中殘留的NOpNO3-和O 2。
4.投加電子受體和標記物:用注射器向每個Labco玻璃進樣瓶(12)中分別注入0.2ml13C-CH4(豐度為99% )，向其中15個實驗組Labco玻璃進樣瓶(12)中注入的事先用高純氦氣曝氣的無02和CO 2的100 μ I 50mg L 4N-NaNO2,向另外15個陰性對照組Labco玻璃進樣瓶(12)中注入的事先用高純氦氣曝氣的無02和0)2的超純水，混勻樣品。
5.培養及取樣:樣品混合均勻后將Labco