用于免疫分析的免疫抑制劑藥物提取試劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及體外診斷試劑領域，特別地，設及改進的免疫抑制劑藥物提取試劑，W 及使用該提取試劑的提取方法和免疫檢測試劑盒，可用于測定患者血液樣品中免疫抑制劑 的濃度水平。
【背景技術】
[0002] 免疫抑制劑（Immunosuppressant)是一類通過抑制細胞及體液免疫反應而減輕 組織損傷的化學或生物物質，廣泛應用于器官移植后的抗排斥反應和治療自身免疫性疾病 (如；類風濕、紅斑狼瘡、強直性脊柱炎和自身免疫性溶血貧血等）。
[0003] 目前常用的免疫抑制劑主要分為微生物代謝產物、糖皮質激素、抗代謝物、抗淋己 細胞抗體、燒化劑等五類，其中他克莫司（Tacrolimus,FK506)、環抱菌素（切closporinA， CsA)、雷帕霉素（Rapamycin，RPM)等微生物代謝產物應用最廣，它們主要通過抑制胞漿內 神經巧蛋白的活性，阻斷IL2等一系列細胞因子的轉錄，從而發揮其免疫抑制作用，有效抑 制T淋己細胞的活化與增殖。
[0004] 對于移植患者的臨床用藥，免疫抑制劑的血液濃度過低則容易導致免疫排斥，而 免疫抑制劑的血液濃度過高，則可能對肝、腎等器官產生毒性，并引發感染、腫瘤等一系列 不良臨床事件，因此，移植患者免疫抑制劑的合理用藥要求精確檢測其血液濃度。對于他克 莫司、西羅莫司、環抱菌素A等常用免疫抑制劑，雖然它們結構各不相同，但在血液中均主 要W蛋白結合物方式存在于紅細胞中，要準確檢測該些免疫抑制劑的血藥濃度，必須使免 疫抑制劑從其結合蛋白上解離下來，該是該類免疫抑制劑血藥濃度檢測的共同要求。
[0005] 目前測定免疫抑制劑血藥濃度的方法主要有受體結合法、HPLC-質譜聯用 (HPLC-M巧、微粒子酶免疫測定（MEIA)、化學發光微粒子免疫測定（CMIA)W及酶聯免疫吸 附法巧LISA)等。其中受體結合法主要用于藥物研究；HPLC-MS法測定血藥濃度準確、靈 敏，但其操作繁瑣，檢測時間長，檢測成本高，需要昂貴設備，主要用于科研領域或作為一種 參考方法。MEIA和CMIA是目前常用的檢測方法，其檢測自動化程度高，檢測結果準確。然 而，上述方法在檢測過程中均需使用甲醇、己膳、己離等有機溶劑作為樣品提取試劑，W溶 解細胞和提取藥物，該提取步驟不僅給實驗操作和實驗后處理帶來不便，而且會不同程度 地降低免疫檢測的靈敏度和準確性，因為進入免疫反應體系的有機溶劑會不可避免地抑制 抗體-藥物之間的免疫結合反應，降低抗體的結合力，進而降低檢測敏感度；另外，提取試 劑中有機溶劑的揮發也容易引起藥物濃度的波動，影響檢測結果的準確性。
[0006] 為降低有機溶劑對抗體結合FK506的抑制作用，RobedW.Siegel等人（Clinical Chemistry, 2008, 54:6, 1008-1017;化t.No.:US8022188B2)通過基因誘變方式對抗體的 互補決定區加W改造，使檢測靈敏度得到改善；但該方法需要核酸提取、擴增、測序、基因誘 變、克隆篩選等復雜步驟，實用性不強。為了降低有機溶劑揮發引起的藥物濃度波動，Frank C.Grenier等人采用低揮發性的DMS0配制血液藥物提取試劑扣S2008/0020401A1)，但該 方法中所用的DMS0仍會嚴重抑制免疫檢測體系中的抗體-藥物間的結合反應，從而降低檢 測靈敏度；另外，同上述所有有機溶劑提取試劑一樣，提取試劑的溶胞作用依賴高濃度的二 價金屬離子（lOmM-lOOmM),且二價金屬離子濃度的變化會導致提取效果的改變，因此全血 樣品中常用絡合物抗凝劑（如；邸TA)的濃度變化可能引起提取試劑中二價金屬離子的濃 度變化，進而導致不同樣品藥物提取效果的差異，造成測量誤差。
[0007] 上述提取試劑處理后的樣品均為非均質溶液，使用前需要離屯、去除固體雜質；該 步驟也增加了操作的難度，延長了檢測時間。
[000引為避免有機溶劑對免疫檢測的影響，FrangoisLegay等人提出了WRAPA作為FK506的置換試劑的FK506檢測方法扣SPat. 6187547B1);由于FK506和RAPA在血液中均 主要與F邸P(FK結合蛋白）結合，少量與血清白蛋白和脂蛋白結合，且高度脂溶性的FK506 和RAPA均可隊陜速穿透細胞膜，因此，免疫分析體系中高濃度的RAPA可隊陜速、有效地將 血液中的FK506置換出來，且無需溶胞和蛋白變性；由于抗FK506抗體的高度特異性，高濃 度的RAPA不干擾FK506的免疫檢測；由于無需藥物提取，該方法檢測FK506更簡單、快捷， 可W準確檢測大部分不含干擾因子的樣品，但對于某些強干擾樣品，尤其是使用了抗體類 免疫抑制劑的患者樣品，即使使用了相應的抗干擾措施，W該方法檢測FK506仍常出現很 大的誤差。
[0009] 因此，免疫抑制劑血藥濃度的檢測迫切需要一種可W避免使用有機溶劑，又能夠 準確、快速、簡便地檢測藥物濃度的藥物提取方法。目前，國內外未見具備上述特點的提取 試劑和提取方法的報道。
【發明內容】
[0010] 為了克服W有機溶劑提取藥物的上述弊端，本發明提供了一種新的用于免疫分析 的血液樣品免疫抑制劑藥物提取試劑和方法。所述藥物提取試劑由蛋白變性劑、蛋白水解 酶、表面活性劑和抑緩沖液組成。所述提取方法包括將樣品與提取試劑按一定比例混合、 解育，在蛋白變性劑和蛋白酶作用下溶解細胞，釋放胞內藥物。本發明無需使用有機溶劑， 能有效溶解血液細胞，釋放胞內藥物。同現有的提取試劑相比，本發明提供的藥物提取試 劑和方法，不僅避免了溶劑揮發導致的藥物濃度改變問題，同時顯著降低了溶液介質對抗 體-藥物間免疫結合的抑制作用。另外，本方法處理后的全血樣品為全透明的均質溶液，處 理后的樣品可直接使用，無需離屯、，有效簡化了樣品處理步驟，縮短了檢測時間。
[0011] 因此，本發明的第一個目的在于提供一種從血液樣品中提取免疫抑制劑的提取試 劑。
[0012] 本發明的第二個目的在于提供一種用于檢測血液樣品中免疫抑制劑濃度的方法。
[0013] 本發明的第=個目的在于提供一種用于檢測血液樣品中免疫抑制劑濃度的試劑 盒。
[0014] 為了達到上述目的，本發明提供了如下技術方案：
[0015] 根據本發明的第一個方面，一種從血液樣品中提取免疫抑制劑的提取試劑，包括 蛋白變性劑、蛋白水解酶、表面活性劑和抑緩沖液。
[0016] 根據本發明，所述蛋白變性劑選自；尿素、鹽酸脈、或者其他非有機溶劑類蛋白變 性劑。
[0017] 根據本發明的優選實施例，所述蛋白變性劑為尿素。
[001引根據本發明，所述尿素在提取試劑中的濃度為4mol/l-12mol/l，所述鹽酸脈在所 述提取試劑中的摩爾濃度為lmol/l-8mol/L;優選的，所述尿素在所述提取試劑中的濃度 為6mol/l-8mol/l，所述鹽酸脈在所述提取試劑中的摩爾濃度為2mol/l-6mol/L。
[0019] 根據本發明，所述蛋白水解酶選自；枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、分散酶等蛋白酶 類或者其混合物；優選的，所述蛋白水解酶為枯草桿菌蛋白酶。
[0020] 根據本發明，所述枯草桿菌蛋白酶在所述提取試劑中的量為lU/na-20U/ml;優選 的，為 2.抓/na-lOU/ml。
[0021] 根據本發明，所述表面活性劑選自：吐溫-20、皂素、TritonX-100中的一種或多 種；優選的，為吐溫-20。
[0022] 根據本發明，所述吐溫-20在所述提取試劑中按體積占比為0. 005% -1% (v/v); 優選的，為 0. 02%-0. 1% (v/v)。
[0023] 根據本發明，所述抑緩沖液的抑在6. 5-8. 5之間；優選的，為7. 0-8.0。
[0024] 根據本發明的第二個方面，一種用于血液樣品中免疫抑制劑藥物濃度檢測的方 法，包括使用所述的提取試劑在加熱條件下處理血液樣品，通過蛋白變性劑、蛋白水解酶、 表面活性劑的協同作用，在溶解血液細胞、釋放藥物的同時，將血液樣品轉變為均質溶液， 該均質溶液可W無需離屯、，直接應用于免疫分析，獲得準確的免疫抑制劑藥物濃度。
[0025] 根據本發明，所述免疫抑制劑包括他克莫司、西羅莫司、依維莫司、佐他莫司、環抱 霉素或其他結構類似物。
[0026] 根據本發明，所述血液樣品