一種基于免疫金的電化學傳感元件的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及電化學技術領域，尤其涉及一種基于免疫金的電化學傳感元件的制備 方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 硝基咪唑類抗生素包括甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、洛硝噠唑、異丙硝唑等，是畜 禽飼料中常用的抗原蟲感染及抗菌藥，并具有促生長作用，還能與其他抗生素聯合使用于 治療厭氧菌感染。但是該類藥物及其某些代謝物對哺乳動物具有致癌、致畸、致突變作用和 遺傳毒性，被許多國家列為違禁藥物。在歐盟，洛硝噠、地美硝唑和甲硝唑分別在1993年、 1995年和1998年被禁止用于食用動物，2002年美國食品與藥物管理局公布了禁止在進口 動物源性食品中使用的11種藥物，其中包括地美硝唑及其他硝基咪唑類藥物。我國農業 部和國家藥品監督管理局第227號公告規定甲硝唑、地美硝唑及其鹽、酯及制劑不準以促 進動物生長為目的在所有食品動物飼養過程中使用。
[0003] 目前在國內，測定硝基咪唑類獸藥的方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質譜聯用 法、高效液相色譜法和高效液相色譜質譜聯用法等。但是這些方法的檢測設備昂貴、樣品前 處理復雜，同時還需要較高水平的專業人員進行操作，很難滿足對批量樣品進行快速檢測 和現場檢測的要求。
[0004] 近年來，由于免疫傳感器技術具有分析速度快、可信度高、適合樣品初級篩選檢測 等優點，許多學者研宄紛紛研宄農藥、獸藥和抗生素等小分子的免疫傳感器檢測方法，具有 靈敏度高、檢測費用低、靈活快捷等優點，其關鍵技術是抗體固定，即把抗體固定在電極上 制備高靈敏的電化學免疫傳感元件。
【發明內容】
[0005] 甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、洛硝噠唑、異丙硝唑等都具有相類似的咪唑結構（1、2、 3位上取代基不同），本發明針以甲硝唑的醇基為連接臂，合作半抗原和免疫原、包被原，制 備抗體，同時發揮納米材料表面積大的優勢，制備免疫金，且與備金-巰基丙酸單分子膜聯 接，制備一種高靈敏的硝基咪唑類藥物殘留電化學傳感元件，為抗生類藥物殘留的快速檢 測和現場檢測提供支撐。
[0006] 本發明采用如下技術方案：
[0007] 本發明的基于免疫金的電化學傳感元件的制備方法的具體步驟如下：
[0008] (1)用0· lmol/L NaOH和0· lmol/L HNO3分別淋洗金電極三次，每次lmin，再置于 新鮮配制的piranha溶液，浸泡30min ;
[0009] (2)取出金電極，超純水淋洗lmin，置于超純水中超聲清洗3min，無水乙醇中超聲 清洗3min，重復3次；
[0010] (3)依次用〇· 3 μ m和0· 05 μ mAl203粉末拋光至呈鏡面后，金電極置于piranha溶 液，浸泡30min，重復步驟（2)，然后用高純氮吹干金電極表面；
[0011] (4)把金電極浸于三巰基丙酸溶液中溫育12h，依次用超純水、無水乙醇淋洗三 次，每次lmin，然后用高純氮吹干金電極表面，即為MPA/金電極，然后將金電極浸于碳二亞 胺鹽酸鹽溶液和N-羥基硫代琥珀亞胺溶液的混合液中12h后，用超純水淋洗3min，再將金 電極浸于含有免疫金的磷酸緩沖液中，4°C過夜，最后用超純水清洗，高純氮吹干金電極表 面，即為免疫金/MPA/金電極。
[0012] 步驟（1)和步驟（3)中，所述的piranha溶液是由30wt %的H2O2和濃硫酸組成， 兩者的體積比為1:3。
[0013] 步驟⑷中，所述的三巰基丙酸溶液的濃度為0. lmol/L。
[0014] 步驟⑷中，所述的碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基硫代琥珀亞胺溶液的濃度均為 0· lmol/L，混合液中兩者的體積比為1:1〇
[0015] 步驟⑷中，所述的磷酸緩沖液的pH為7. 4。
[0016] 步驟（4)中，所述的免疫金的制備方法如下：
[0017] (a)膠體金的制備
[0018] 將所用器皿用酸液浸泡72h，取出，自來水沖洗，蒸餾水浸泡24h,干燥，用含5wt% 的二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液進行硅化，硅化完成后用雙蒸水沖洗，烘干，取質量濃度 0. 01%氯金酸水溶液IOOmL加熱至沸，300rpm攪拌下加入預熱的質量濃度1%檸檬酸三鈉 水溶液4mL，金黃色的氯金酸水溶液在2min內變為灰色，然后由灰色變為酒紅色，繼續攪拌 煮沸，直至溶液呈透亮的紅色，冷卻后用雙蒸水定容至100mL，4°C冰箱中避光保存；
[0019] (b)免疫金的制備
[0020] 將步驟（a)制備的膠體金和硝基咪唑抗體溶液分別以0.1 Mol/L 1(20)3調pH至 9. 0,電磁攪拌硝基咪唑抗體溶液溶液，加入膠體金溶液，繼續攪拌lOmin，加入5wt % BSA使 溶液終濃度為lwt%，以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀，用15000r/min離心30min， 輕吸上清液，沉淀用含Iwt % PEG的PBS緩沖液懸浮，恢復原體積后再離心，如此洗滌2~4 次，以徹底除去未結合的蛋白質，最終用含lwt% PEG的PBS緩沖液懸浮并保存。
[0021] 步驟（b)中，所述的PBS緩沖液的量為0· 01M，pH為7. 4。
[0022] 步驟（b)中，所述的硝基咪唑抗體的制備方法如下：
[0023] (1)硝基咪唑半抗原MNZ-SA的合成
[0024] 在IOmL燒杯中加入甲硝挫0· 85g、琥?白酸酐I. 25g、無水吡啶lmL，在磁力攪拌器 上攪拌反應4h，可得乳白色液體，將混合物置微波爐內加熱約IOs至混合物剛好沸騰，混 合物變成透明的黃色液體，旋轉蒸發儀減壓除去吡啶得白色固體，加入20mL蒸餾水超聲溶 解，用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，加入5mL乙酸乙 酯超聲溶解后，加入25mL石油醚，靜置，減壓抽濾得白色固體粉末，即為硝基咪唑半抗原 MNZ-SA，真空干燥，放入冰箱中保存備用；
[0025] (2)硝基咪唑免疫原BSA-MNZ
[0026] 用電子天平準確稱取0· 1084g步驟（1)制備的半抗原溶于5mL N，K -二甲基甲 酰胺中，加入31〇11^00：，放在搖床上攪拌1〇1^11，加入20.〇1^順5，混合液室溫避光在搖床 上反應3. 5h，觀察到有白色的沉淀物，用離心機進行離心，取上層清液逐滴加到0. lmol/L， pH8. 0的磷酸緩沖液配置的40mL BSA溶液中，室溫避光在搖床上反應2h，用0. 9wt %的生理 鹽水透析3天，每天換液3次，冷凍干燥即得甲硝唑全抗原白色固體粉末；
[0027] (3)硝基咪唑抗體的制備
[0028] 選取兩只新西蘭大白兔，背部皮下多點注射500 μ g BSA-MNZ，其中BSA-MNZ用生 理鹽水稀釋，加等體積的完全弗氏佐劑充分乳化，在15d，再次注射相同劑量經不完全弗氏 佐劑充分乳化的免疫原，29d、39d和49d，注射250 μ g經不完全弗氏佐劑充分乳化的免疫 原，59d后，耳靜脈取血，測定抗體效價，效價合適后，心臟完全取血，分離及純化抗血清，得 到硝基咪唑抗體。
[0029] 本發明的方法制備的傳感元件可以用于檢測動物性食品中硝基咪唑類藥物殘留。
[0030] 本發明的積極效果如下：
[0031] 本發明根據硝基咪唑類抗生素的結構特點，設計和制備了通用的硝基咪唑類結構 半抗原，并采用活化酯法，將硝基咪唑半抗原與載體蛋白（BSA和0VA)偶聯制備免疫原和包 被原，其結構得到核磁共振圖譜、紅外圖譜和紫外圖譜的鑒定，偶聯分子摩爾比分別為11:1 和10:1。同時制備了硝基咪唑抗體，效價為1:100000,制備免疫納米金；利用單分子膜自組 裝技術在金電極上形成單分子膜，再通過DCC和NHS與免疫納米金聯接，制備了傳感元件。 建立了硝基咪唑類藥物電化學傳感檢測技術，對甲硝挫、替硝挫、地美硝有良好的響應，交 叉反應率達90%以上，可測定0.001-100mg/L濃度范圍內的甲硝唑、替硝唑、地美硝唑及其 代謝物，檢測限約為0. 〇〇19mg/L，回收率約為90%，為進一步建立和完善法檢測動物性食 品中硝基咪唑類藥物殘留提供了支撐。
【附圖說明】
[0032] 圖1是硝基咪唑半抗原的氫核磁共振圖譜。
[0033] 圖2是甲硝唑的紅外光譜圖。