一種基于雙酶修飾電極快速檢測溶液中氨基甲酸乙酯含量的電化學方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用雙酶修飾電極快速檢測溶液中氨基甲酸乙酯含量的電化學方法，屬于分析化學、食品安全檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate，C2H5OCONH2, CAS#51-79-6，簡稱 EC)，是廣泛存在于發酵食品及酒類飲料中的一種副產物。通過對猴子、小白鼠、倉鼠、老鼠等實驗研宄證明，EC是一種具有遺傳毒性和致癌作用的物質，能夠迅速被胃腸束和皮膚快速吸收，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病。主要通過酒精類飲料如黃酒、清酒、葡萄酒、蘋果酒、白蘭地或威士忌等攝入人體內并積累，通過細胞色素P450的代謝而對人體產生致癌作用。基于以上流行病學和實驗數據，EC被國際癌癥組織和美國環境保護署定義為可能的人類致癌物質(2B)，至2007年，被重新歸類為對人類具有致癌作用的2A類致癌物質。鑒于此，世界好多國家先后對飲料酒中氨基甲酸乙酯含量做了限量標準。
[0003]我國人口基數大，每年會生產和消費大量的發酵酒和食品，如米酒、白酒、啤酒和醬油、醋、腐乳等。這就意味著我國會因為大量酒精類飲料和發酵類食品的攝入而積累過量的EC。因此，亟須提出控制和減少我國發酵類食品和酒精類飲料中EC含量的方法和策略，同時需要開發出精確、簡便、廉價、省時的檢測方法也勢在必行。
[0004]目前，國內外普遍采用的氨基甲酸乙酯含量檢測的方法是基于氣質聯用(GC-MS)、高效液相層析(HPLC)等結合其他靈敏性較強的檢測器方法，如液相色譜-電噴射串聯質譜(HPLC-EIS-MS/MS)、高效液相層析-熒光檢測器(HPLC-FLD)、正向液相色譜-氣壓化學電離串聯質譜(NP-LC-APC1-MS/MS)、多維頂空固相微萃取結合氣相色譜和火焰離子化檢測器(HS-SPME/GC/FID)、一維氣相色譜-質譜(MEPS/GC-MS)、高效液相色譜結合Q Exactive雜合四極-軌道阱質譜(UHPLC-MS/MS)等。這些方法雖然能夠在一定程度上對酒類飲料中氨基甲酸乙酯含量進行檢測，但是大多需要對樣品進行預處理，操作繁雜、耗時耗力、重現性差、操作系統誤差大，同時需要二氯甲烷等有機溶劑萃取和洗脫，對操作人員的健康存在安全隱患。另外，萃取過程中會用到大量的有機溶劑，從而需要蒸發去除有機溶劑，導致分離效果較差而影響樣品的回收率和檢測結果的準確性。最重要的是，這些方法所需的各種監測分析系統需要以大型精密儀器作支持，需要專業的操作人員。同時還伴隨著對檢測儀器要求高，對儀器的維修和護理成本高，只能在具有大型、貴重儀器的專業實驗室內進行檢測，難以推廣使用等問題。
[0005]隨著生物傳感器的發展，雙酶和多酶聯用的生物傳感器逐漸引起人們關注并得到了廣泛的應用。現階段已有許多酶傳感器用于水體中氨、尿素、重金屬離子、過氧化氫、苯酚、有機磷殺蟲劑、抗壞血酸、谷氨酸以及其他氨基酸的檢測。但目前還沒有報道用于檢測EC含量的酶傳感器。本發明在前期篩選出產氨基甲酸乙酯降解酶的菌株的基礎上，構建了氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脫氫酶雙酶修飾電極傳感器實現對EC的快速檢測。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種快速檢測溶液中氨基甲酸乙酯含量的電化學方法，要解決的技術問題是構建檢測氨基甲酸乙酯所需要的雙酶修飾電極傳感器。固定在電極表面的氨基甲酸乙醋降解酶(Urethanase, Ure)能夠水解氨基甲酸乙醋產生乙醇、COjP NH4+，在谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase, GLDH)的催化下氨與共底物α-酮戊二酸反應生成谷氨酸，同時伴隨著還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化。從而該體系將氨基甲酸乙酯含量轉化成NADH含量的變化，利用NADH在施加一定電壓后于電極表面產生電流響應值的變化，實現對液態體系中氨基甲酸乙酯含量的檢測。
[0007]本發明的技術方案:一種快速檢測溶液中氨基甲酸乙酯含量的電化學方法，其特征在于利用氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脫氫酶催化的級聯反應將氨基甲酸乙酯EC信號轉換成還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH信號進行電化學檢測，氨基甲酸乙酯降解酶Ure將氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、CO2和氨，在谷氨酸脫氫酶GLDH催化下氨與共底物α -酮戊二酸反應生成谷氨酸，同時伴隨著NADH被氧化，利用特定電壓下NADH在電極表面氧化產生電流信號的變化，對氨基甲酸乙酯含量進行電化學檢測；步驟為:
(1)構建雙酶修飾電極
將0.2%殼聚糖、0.3%明膠和3% γ-(2, 3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷GPTMS加入25 mL 1%醋酸溶液中制備CS/siIane溶膠-凝膠sol-gel體系，將氨基甲酸乙醋降解酶Ure40 U 和谷氨酸脫氫酶GLDH 16 U ^mL ―1加入此有機無機雜化材料中制備CS/gelatin/GPTMS/Ure/GLDH生物復合材料，滴加在石墨電極表面，置于4°C冰箱中干燥成膜，構建成雙酶修飾電極；
雙酶修飾電極傳感器用于EC檢測時最適反應體系為25 mmol ?L_1 PBS緩沖液，最適pH為6.0，反應體系中α -酮戊二酸的最適濃度為10 mmol.L—1，NADH濃度為0.5 mmol.L—1;
(2)建立標準曲線
將雙酶修飾電極置于含有O?500 μ mo I七1濃度EC、300 mmol *L_1a -酮戊二酸200yL、和 7.5 mmol.L-1NADH 400 yL，用 ρΗ6.0、25 mmol.L-1PBS 緩沖液定容至 6 mL，將所得的溶液混合均勻后，立即插入雙酶修飾電極，施加0.55 V電壓，進行電流-時間掃描，反應5 min，觀察NADH在電極表面產生的電流響應曲線在120 s時的電流響應變化值，將EC濃度和電流響應曲線在120 s處的電流響應值在5 min內的變化值對應，制作標準曲線；
(3)計算樣品中EC含量
將雙酶修飾電極置于待測黃酒樣品中反應5 min后，檢測NADH在電極表面產生的電流響應曲線在120 s處的電流響應變化值，通過對比標準曲線計算待測黃酒樣品中氨基甲酸乙酯含量。
[0008]建立的方法能夠快速檢測并準確定量溶液樣品中的氨基甲酸乙酯含量，在模擬黃酒樣品中的檢測限為5.26 nmol.L—1，線性相關系數為0.9989，EC回收率為95.17%-103.79%，相對標準差為 2.86%_8%。
[0009]所述雙酶修飾電極傳感器的重復性、再現性、抗干擾性能和存貯穩定性均良好。
[0010]本發明的有益效果:本發明通過對雙酶修飾電極傳感器的構建條件、最適反應緩沖體系以及檢測液中a -酮戊二酸濃度等多個實驗進行優化，成功構建了一個雙酶傳感器，建立了快速檢測氨基甲酸乙酯的電化學方法。該方法克服了傳統方法中的諸多不足。
【附圖說明】
[0011]圖1雙酶修飾電極傳感器最適反應緩沖體系確定。
[0012]圖2雙酶修飾電極傳感器電化學方法檢測氨基甲酸乙酯濃度標準曲線。
【具體實施方式】
[0013]實施例1.CS/silane溶膠-凝膠體系溶液中殼聚糖(CS)、明膠(gelatin)和γ-(2，3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)最適添加量確定。
[0014]在構建雙酶修飾電極傳感器之前，首先對CS/silane溶膠-凝膠體系溶液中殼聚糖、明膠和GPTMS的濃度進行條件優化。
[0015]首先將0、0.025,0.05,0.075,0.10及0.125 g殼聚糖粉末分別溶于25 mL 1%醋酸溶液中，攪拌均勻，制備殼聚糖(質量體積百分，下同)濃度分別為0，0.1%，0.2%, 0.3%, 0.4%及0.5%的溶液。待殼聚糖完全溶解后，向溶液中添加I mol -Γ1 NaOH溶液調節pH至6.0。添加1%甘油作保護劑。取50 μ L殼聚糖溶液與25 μ L 16 U.mL—1氨基甲酸乙酯降解酶和25 μ L 16 U.mL—1谷氨酸脫氫酶，混合均勻。滴加15 μ L上述CS/silane生物混合溶液于熱解石墨電極表面，置于4°C冰箱中干燥成膜，制備CS/Ure/GLDH雙酶電極傳感器。將上述條件下制備的分別含有0，0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%和0.5%殼聚糖的雙酶修飾電極傳感器置于含有 0.5 mmol.L^1EC,0.5 mmol.L—1 α -酮戊二酸和 0.5 mmol.T1NADH 的檢測溶液中進行電流-時間掃描。分別觀察5 min反應時間后，檢測溶液中的NADH在電極表面電流響應值的大小。結果表明，當殼聚糖濃度為0.2%時，制備的雙酶修飾電極傳感器在反應5 min后在電極表面產生的NADH的電流響應值最小。所以CS/Ure/GLDH溶液中CS的最佳濃度為0.2%。
[0016]在確定殼聚糖濃度的基礎上，向0.2%殼聚糖溶液中分別添加0、0.025、0.05、0.075,0.10及0.125g明膠，即明膠濃度分別為0,0.1%，0.2%，0.3%，0.4%及0.5%，攪拌。待明膠完全溶解后，向溶液中添加I mol.Γ1 NaOH溶液調節pH至6.0。添加1%甘油作保護劑。取50 yL CS/gelatin溶液與25 μ L 16 U.ι?Γ1氨基甲酸乙酯降解酶和25 μ L 16U 谷氨酸脫氫酶，混合均勻。滴加15 μ L所述CS/silane生物混合溶液于熱解石墨電極表面，置于4°C冰箱中干燥成膜，制備CS/gelatin/Ure/GLDH雙酶修飾電極傳感器。將上述條件下所得的雙酶修飾電極傳感器分別置于含有0.5 mmol.I^1ECX0.5 mmol.L—1 α -酮戊二酸和0.5 mmol.T1NADH的檢測溶液中進行電流-時間掃描。分別觀察5 min反應時間NADH電流響應值的大小。當明膠濃度為0.3%時，反應5 min后NADH的電流響應值最小。所以CS/gelatin/Ure/GLDH溶液中明膠的最佳濃度為0.3%。
[0017]向含有0.2%殼聚糖和0.3%明膠的溶液中分別