一種檢測b族鏈球菌的電化學傳感器及其制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及核酸檢測領域，尤其涉及一種檢測B族鏈球菌的電化學傳感器及其制 備與應用。
【背景技術】
[0002] B族鏈球菌（GBS)是一種革蘭陽性球菌，正常寄居于人體的陰道和直腸，屬于一種 條件致病菌，能引起嚴重的敗血癥和新生兒腦膜炎感染，是造成孕婦產褥感染的主要致病 菌，也是產婦死亡的四大原因之一。GBS在孕婦中的感染率高達20 % -40 %，其中母嬰垂直 傳播的比例高達75 %并且會有將近1 %受感染的嬰兒發展成早發型的GBS敗血癥。鑒于上 述GBS的高感染性和危害性，對孕婦進行產前篩查顯得尤為必要。根據2002年美國疾病控 制與預防中心發布的GBS預防指南中指出，對于懷孕35-37周的孕婦，進行陰道或直腸的病 菌培養。這些準則的實施降低了早發型GBS新生兒的發病率，在1000個存活的嬰兒中，發 病率從1. 5降到了 0. 3。當前診斷GBS的金標準，是在選擇性的肉湯培養基中培養陰道或者 直腸拭子上的分泌物，整個過程需要48小時。這種培養的方法能直觀的做出結果判讀，容 易展開成本低，可進行藥敏學分析，但是其耗時長，特別不適合臨產時孕婦不知道自身是否 有GBS感染的情況，且48h以上GBS培養難度較高，靈敏度低，實驗操作人員需要較深的經 驗。此外，細菌抗原檢測操作簡便，成本較低，但是需要培養后進行檢測，花費時間較長，且B 族鏈球菌血清型較多，容易造成漏檢，靈敏度相對較低；全面自動化的微生物自動分析鑒定 系統也需花費較長的時間，成本高且設備昂貴。目前，臨床上采用的最廣的方法是實時熒光 PCR，采用設計好的熒光探針，PCR法進行核酸擴增，該探針是選擇B族鏈球菌的表面免疫源 性蛋白（基因 ID :1012782)的保守序列，該序列在所有GBS中都存在，此方法與標準的細菌 培養方法在GBS檢測的敏感性和特異性方面均達到90 %以上，重復性好，檢測快速，操作簡 單，但操作過程需要不斷的溫度循環，專門的PCR實驗室及熒光PCR儀，且需設計引物，從而 限制了該方法的使用。
[0003] 因此，為適應臨床診斷治療，特別是床旁檢測（POCT)的需求，現有技術旨在建立 一種GBS電化學傳感器用于GBS快速、靈敏、特異及符合POCT要求的檢測手段。
【發明內容】
[0004] 鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種檢測B族鏈球菌 (GBS)的電化學傳感器，包括工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極為在基底電極 金電極表面固定捕獲探針（Capture Probe)所得，所述傳感器還包括與所述捕獲探針 (Capture Probe)相匹配的模板探針（Template Probe)、延伸探針（Extension Probe)、檢 測探針（Detection Probe) 〇
[0005] 優選地，所述模板探針（Template Probe)與延伸探針(^Extension Probe)之間有 多個堿基互補配對，所述模板探針（Template Probe)與延伸探針（Extension Probe)分別 與待測B族鏈球菌單鏈DNA靶序列（GBS ssDNA)的不同部位之間有多個堿基互補配對，所 述模板探針（Template Probe)、延伸探針（Extension Probe)與待測B族鏈球菌單鏈DNA 靶序列（GBS ssDNA)結合后在DNA聚合酶和RNA聚合酶的作用下，形成單鏈RNA，所述單鏈 RNA與檢測探針（Detection Probe)以及所述捕獲探針（Capture Probe)均互補結合。
[0006] 優選地，所述待測B族鏈球菌單鏈DNA靶序列（GBS ssDNA)如SEQ ID NO. 1所示， 具體為：
[0007] GAC ACC AGA AGC AGC MC MC GAT TGT TTC GCC MT GAA GAC ATA TTC TTC TGC GCC AG0
[0008] 優選地，所述模板探針（Template Probe)與延伸探針(^Extension Probe)之間有 5~7個堿基互補配對。更優選地，所述模板探針（Template Probe)與延伸探針（Extension Probe)之間有6個堿基互補配對。
[0009] 優選地，所述模板探針（Template Probe)的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，
[0010] 具體為：5'-GTG GCT GTT CTA GGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAA ACG AAC GAA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-3'。
[0011] 優選地，所述延伸探針（Extension probe)的核苷酸序列SEQ ID NO. 3~5所示。
[0012] 具體地：
[0013] 當T/E堿基配對個數為6時，模板探針（Template Probe)的核苷酸序列為：5'_GTG GCT GTT CTA GGT MT CGA TGC CTG GGA MG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AM ACG AAC GAA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3'（SEQ ID NO. 2);延伸探針（Extension probe)的核苷酸序列為：5'-GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTC GTT-3'（SEQ ID NO. 3)；
[0014] 當T/E堿基配對個數為5時，模板探針（Template Probe)的核苷酸序列為5'_GTG GCT GTT CTA GGT MT CGA TGC CTG GGA MG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AM ACG AAC GAA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3'（SEQ ID NO. 2);延伸探針（Extension probe)的核苷酸序列為 5' -GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTC GT-3'（SEQ ID NO. 4) 〇
[0015] 當T/E堿基配對個數為7時，模板探針（Template Probe)的核苷酸序列為：5'_GTG GCT GTT CTA GGT MT CGA TGC CTG GGA MG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AM ACG AAC GAA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3'（SEQ ID NO. 2);延伸探針（Extension probe)的核苷酸序列為：
[0016] 5' -GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTC GTT T-3'（SEQ ID NO. 5)。
[0017] 進一步優選地，所述模板探針（Template Probe)的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所 示，具體為：5' -GTG GCT GTT CTA GGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAA AAC GAA CTA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-3'。
[0018] 進一步優選地，所述延伸探針（Extension probe)的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7 所示，具體為：5' -GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GTA TTC GTT-3'。
[0019] 當所述模板探針（Template Probe)和所述延伸探針（Extension probe)分別有 兩個堿基與待測B族鏈球菌單鏈DNA靶序列有兩個堿基不互補時，三者之間結合時，會形成 一個帶有空泡的不完美T型結構，大大減小了模板探針和延伸探針與靶序列之間結合的空 間位阻，從而大大降低了背景信號，提高了信噪比，使實驗結果更為理想。
[0020] 優選地，所述檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，具體為：5'-TTT TTT TTT GTG GCT GTT CTA GGT AAT CG-3' 。
[0021] 更優選地，所述檢測探針為生物素（Biotin)修飾的檢測探針，核苷酸序列為：
[0022] 5'-Biotin-TTT TTT TTT GTG GCT GTT CTA GGT AAT CG-3' 。
[0023] 優選地，所述捕獲探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，具體為：
[0024] 5'-ATG CCT GGG AAA GTC CCC TCT TTT TT-3' 。
[0025] 優選地，所述捕獲探針為巰基修飾的捕獲探針，核苷酸序列為：
[0026] 5'-ATG CCT GGG AAA GTC CCC TCT TTT TT-SH-3' 。
[0027] 優選地，每個所述工作電極上，含有所述捕獲探針的摩爾量為Ipmol~IOpmol，更 優選為2pmol〇
[0028] 進一步地，所述電化學傳感器中的參比電極和對電極與工作電極構成三電極系 統。
[0029] 優選地，所述參比電極選自飽和甘汞電極或銀氯化銀電極（Ag/AgCl)之任意一 種；更優選地，所述參比電極為銀/氯化銀（Ag/AgCl)電極。
[0030] 優選地，所述對電極為鉑絲電極。
[0031] 優選地，所述電化學傳感器還進一步包括鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶和含 a -NP的緩沖液。
[0032] 更優選的，所述緩沖液為二乙醇胺（DEA)緩沖液。
[0033] 本發明第二方面提供了前述電化學傳感器中的工作電極的制備方法，所述方法為 先在基底電極金表面固定捕獲探針，而后進行封閉電極所得。
[0034] 優選地，所述工作電極按照以下步驟制備：
[0035] (1)金電極表面處理：將金電極表面進行拋光處理，使其表面光潔；
[0036] (2)固定捕獲探針：將捕獲探針滴涂在處理干凈的金電極表面；
[0037] (3)封閉電極：封閉非特異性吸附位點，即得工作電極。
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