腎癌血液生物標志物(Biomarker)的檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種腎癌血液生物標志物的檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 腎臟在身體中扮演著過濾裝置的角色，能夠從血液中去除廢物、多余水分及鹽分。 腎癌通常表示發生在腎臟的實質部（腎臟中制造尿的細胞集聚而成的部分，其由髓質與皮 質構成）的腎細胞癌（renalcellcarcinoma)。典型地，腎細胞癌通常W發生在一側腎臟 的單一腫瘤為典型例，但有時候也會侵犯到兩側腎臟。
[0003] 腎細胞癌可W分類為透明細胞型腎細胞癌（clearcellRCC)、乳頭狀腎細胞 癌（papillaryRCC)、嫌色性腎細胞癌（C虹omo地obeRCC)、髓質性腎細胞癌（medullary RCC)、未分類腎細胞癌（unclassifiedRCC)、腎孟移行細胞癌化i化eytransitionalcell carcinoma,TCC)、腎嗜酸細胞癌（ranaloncocytoma)等，其中，透明細胞型腎細胞癌占 66~75%，乳頭狀腎細胞癌占15 %左右，嫌色性腎細胞癌占5 %左右。
[0004] 腎細胞癌可W根據Roboson分期體系如下分類，局限于實質部內的腫瘤稱為第一 期，浸潤到腎皮膜外或者局限于腎筋膜內的腫瘤稱為第二期，轉移到腎臟周圍血管或淋己 結時稱為第=期，侵犯到腎臟周圍的其它臟器或者發生遠距轉移時稱為第四期。第一期還 根據腫瘤大小而如下區分，腫瘤大小低于4cm時稱為la，4cmW上時稱為Ib，第S期則對侵 犯到腎靜脈或下腔靜脈等腎臟周圍血管者稱為III/a期，如果轉移到腎臟周圍淋己結則稱 為III/a期。
[0005] 腎癌主要發生在60~70歲的老年層并且呈現出持續增加的趨勢，在韓國的男性 癌癥病人中W2.0%占據第10位，在韓國女性癌癥病人中W1.2%占據第15位。腎癌在腫 瘤大小較小時幾乎沒有任何癥狀，腫瘤生長到一定大小而成為推擠臟器的程度時才會出現 癥狀。最常見的癥狀是血尿，但也僅呈現在60%左右的患者。因此，常常出現診斷過遲的情 形而在第一次診斷出來時大約有30%的患者已經處于轉移狀態，并且根據轉移的部分而出 現呼吸困難、咳嗽、頭痛之類的癥狀。
[0006] 大多數情況下，診斷腎癌時利用x-ray、CT攝影、超聲波及組織分析之類的方法。 該些方法難W區分各種形式的腎癌，需時較長，勞動力的投入較多。
[0007] 本發明的技術方案則把能夠適用于腎癌早期診斷及非侵入性診斷的3種腎 癌血液生物標志物NNMT(NicotinamideN-meth}dtransferase)、LCP1 (L-Plastin)及 NM23A(Non-metastaticcellsIprotein)加W組合?利用而得W提高腎癌診斷能力。
[000引解決的技術課題
[0009] 本發明的目的是提供一種腎癌血液生物標志物的檢測方法。
[0010] 本發明的另一個目的是提供一種腎癌血液生物標志物的檢測試劑盒化it)。
[0011] 本發明的其它目的或具體目的將在后述說明中得到闡述。
[0012] 解決課題的技術方案
[0013] 本發明提供一種腎癌血液生物標志物的檢測方法。
[0014] 本發明人利用取自腎癌患者100人與正常人90人的共190個血液試劑進行了預 備實驗并且得知患者群的NNMT、LCP1及醒23A的血中濃度高于正常人群，從而得W確認該 些蛋白質具有作為腎癌血液生物標志物的可能性，把上述3種腎癌血液生物標志物組合后 通過ROC(ReceiverOperatingCharacteristic)曲線分析法對腎癌診斷能力進行評估時， 發現該些標志物的診斷能力得到了提升。具體地說，3種血液生物標志物中診斷能力最強 的NNMT(在NNMT、LCP1及NM23A等3種標志物中NNMT的診斷能力最高，請參考下列實施 例）的準確度（AUC)為0. 927,特異度為95 %時靈敏度為69 %，但是把3種血液生物標志物 組合后適用逐步邏輯回歸分析法（stepwiselogisticregressionanalysis)時，準確度 為0.9333,特異度為95 %時靈敏度為77%，適用下列實施例中的計分法（scoringmethod) 時，AUC為0. 948,特異度為95 %時靈敏度為89%。
[0015] 更進一步，W使用該190個血液試劑的預備實驗的結果為基礎，本發明人根據基 于上述計分法的上述3種腎癌血液生物標志物的組合對30個正常人血液試劑與29個患 者血液試劑實際進行盲試化lindtest)實驗并且在其結果發現能夠把正常人30人中的 29人識別成正常人而能夠把患者29人中的28人識別成患者（亦即，靈敏度96. 67% = 29/30X100(% )、特異度 96. 55%= 28/29X100(% ))。
[0016] 本發明的腎癌血液生物標志物的檢測方法是W該實驗結果為基礎提供的，具體地 說，其包括下列步驟；步驟（a)，讓取自受檢人的血液試劑或其加工試劑與特異于各個腎癌 血液生物標志物NNMT、LCP1及醒23A的結合分子反應，讓存在于上述試劑的腎癌血液生物 標志物NNMT、LCP1及醒23A各自和特異于它的結合分子形成結合體；及步驟化），檢測上述 結合體。
[0017] 在上述內容中，NNMT(nicotinamide-N-meth}dtransferase)是一種參與到煙酷胺 (nicotinamide)的甲基化轉移（N-methylation)的酶并且由總共264個氨基酸組成，其分 子量為29. 6邸a。其基因序列被揭不為GeneBankAccessionnumber:NM_006169,其氨基酸 序列被揭示為GeneBankAccessionnumber:NP_006160. 1。
[001引在上述內容中，LCP-l(L-Plastin)是肌動蛋白結合蛋白系列的一種，其具有L型 與T型等兩種形態，其中的L型被認為只在hemopoieticcell表達，總共由627個氨基酸組 成，分子量為70. 8邸a。其基因序列被揭不為GeneBankAccessionnumber:NM_002298. 4， 其氨基酸序列被揭示為GeneBankAccessionnumber:NP_002289. 1。
[0019] 而且，在上述內容中，醒23A是被認為在腫瘤轉移較為活潑時mRNA量減少的基因 的蛋白質醒23的A型異構體。總共由152個氨基酸組成，分子量為16. 9KDa。其基因序 列被揭不為GeneBankAccessionnumber:NM_198175. 1，其氨基酸序列被揭不為GeneBank Accessionnumber:NP_000260.l〇
[0020] 能夠憑借本發明的檢測方法把血液中的腎癌血液生物標志物NNMT、LCP1及NM23A 全部予W定量，該些定量值則由醫師之類的醫療專家用來判斷腎癌罹患與否、腎癌發展程 度及/或腎癌治療經過。
[002U 尤其是，本發明的檢測方法能夠把腎癌血液生物標志物NNMT、LCP1及醒23A全部 檢測，因此即使如下列實施例所述地應用于腎癌初期階段的第一期患者也能呈現出96%的 特異度（把正常人120人中的115人識別成正常人，96%= 115/120X100)及95%的靈敏 度（把第一期的患者59人中的56人識別成患者），從而能夠非常有效地適用于腎癌的早期 診斷（作為參考，作為單一生物標志物而具有最強診斷能力的NNMT也只呈現出86%的特 異度與92%的靈敏度），而且對腎細胞癌類型中占大多數的透明細胞型腎細胞癌也呈現出 96%的靈敏度而能夠非常有效地適用于透明細胞型腎細胞癌的診斷（作為參考，作為單一 生物標志物而具有最強診斷能力的NNMT也只呈現出93%的靈敏度）。
[0022] 在本說明書中，"血液的加工試劑"指的是血漿或血清。
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