一種胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ聯合檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于體外診斷試劑技術領域，具體涉及一種胃蛋白酶原I和II聯合檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]胃癌是全球高危死亡率的第二大疾病，嚴重威脅著人類健康。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居各種惡性腫瘤前列，全球每年934，000新發胃癌病例，42% (近40萬)的新發病例數在我國，胃癌在我國的患病率和死亡率均是世界水平的2倍多。其早期診斷、早期治療是提高患者生存質量、降低死亡率的唯一途徑，改善胃癌患者預后的關鍵是作好二級預防，血清PG檢測可以作為胃癌篩查“二步法”中的初篩方法。近年來，血清PG含量的變化與胃癌及其他胃部疾病的關系及其作為初篩手段在胃癌篩查中的應用已引起越來越多研究者的關注。聯合測定PG I和PG II的水平及其比值可起到胃黏膜“血清學活檢”的作用，有利于胃癌的預防干預、早期診斷以及術后復發預測。
[0003]PG (PG)是一種門冬氨酸蛋白酶前體，是分子質量為42KDa的單鏈多肽。人類PG依其電泳遷移率可以分為7個組分，1-5組分的免疫原性相同，稱為PG I (PG I)，主要由胃腺的主細胞和黏液頸細胞分泌；組分6-7被稱為PG II (PG II)，除由胃體和胃底黏膜的泌酸腺的主細胞分泌外，泌酸腺的黏液頸細胞、賁門腺和胃竇的幽門腺的黏液細胞以及十二指腸上段的Brunner腺也能產生PG II。由于胃幾乎是PG的唯一來源，并且在分泌階段的分泌量會發生變化，因此，血清PG I和PG II不僅反映了胃黏膜腺體和細胞的數量，也間接反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。
[0004]通常情況下約有1%的PG通過胃黏膜進入血液循環，進入血液循環的PG在血液中非常穩定。血清PG水平是反映胃黏膜形態和功能的良好指標。大部分酶原進入胃腔，經酸解成具有活性的胃蛋白酶發揮其消化蛋白質的作用。但也有少量透過胃黏膜毛細血管進入血液，可從血清中檢測。當胃粘膜發生病變時，血清中PG的含量也隨之發生改變。血清PG含量的變化與胃癌及其他胃部疾病的關系及其作為初篩手段在胃癌篩查中的應用已引起越來越多研究者的關注。研究發現，在常規體檢中大約有15%左右的人的血清PG水平異常，而進一步進行胃鏡檢查，其中90%以上的患者有不同程度的淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌等胃部疾病。近年來，血清PG含量的變化與胃癌及其他胃部疾病的關系及其作為初篩手段在胃癌篩查中的應用已引起越來越多研究者的關注。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種胃蛋白酶原I和II聯合檢測試劑盒，可同時檢測PG I和PG II兩個項目，檢測結果可用于胃部疾病的初篩。
[0006]本發明提供一種胃蛋白酶原I和II聯合檢測試劑盒，包括已包被抗PG I和PG II抗體的酶聯板，所述抗PG I抗體是將PG I抗原部分基因序列PG 1-A和PG 1-B分別通過基因工程克隆表達得到PG 1-A和PG 1-B重組蛋白，并利用克隆表達的重組蛋白免疫小鼠制備得到單克隆抗體；所述PG 1-A的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.1，所述PG 1-B的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2 ;所述抗PG II抗體是將PG II抗原基因序列通過基因工程克隆表達得到PG II重組蛋白，并利用克隆表達的PG II重組蛋白免疫小鼠制備得到單克隆抗體，所述PG II抗原的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.3。
[0007]優選地，所述試劑盒還包括酶標抗體，所述酶為辣根過氧化物酶，所述抗體為PG 1-A, PG 1-B和PG II的單克隆抗體。
[0008]優選地,所述試劑盒還包括酶標抗體稀釋液,所述稀釋液的配方為:0.1M Tris鹽酸緩沖液，0.1%-1%BSA, 0.5%-2.0% 酪蛋白，1%-6% (NH4) 2S04,1%-5%SDS, 0.1%-1% 甘油，
0.01%-0.1%DDT，5-10% 蔗糖，ρΗ8.5。
[0009]優選地，所述包被時的包被液為:0.1M碳酸鹽緩沖液，pH值為9.6 ;包被濃度為5 μ g/mlο
[0010]優選地，封閉所述抗PG I和PG II抗體時使用的封閉液為:0.2M磷酸鹽緩沖液，1%BSA, 2.0%酪蛋白；封閉液的pH值為7.4。
[0011]本發明還提供應用上述試劑盒聯合檢測胃蛋白酶原I和II的方法，步驟如下:
(1)在微孔板反應孔中分別加入10μ I校準品、質控品和待測樣本，再加入90 μ I稀釋的酶標抗體，混勻；
(2)37°C孵育45分鐘；洗滌；
(3)加入底物顯色，加入終止液，在酶標儀上讀取OD45tl數值，繪制胃蛋白酶原I標準曲線和胃蛋白酶原II標準曲線，根據胃蛋白酶原I標準曲線和胃蛋白酶原II標準曲線計算待測樣本中胃蛋白酶原PG I和PG II具體含量。
[0012]優選地，步驟(I)中酶標抗體的稀釋倍數為1000倍。
[0013]本發明的第三個目的是提供PG 1-A, PG 1-B和PG II在制備聯合檢測胃蛋白酶原I和II試劑盒中的應用。
[0014]本發明的第四個目的是提供PG 1-A、PG 1-B和PG II在聯合檢測胃蛋白酶原I和II中的應用。
[0015]本發明基于雙抗夾心方法，利用抗原抗體特異性反應來檢測血清中PG I和PG II的含量。本發明運用酶聯免疫一步法快速檢測技術，使用以0.1M碳酸鹽緩沖液(PH9.6)為包被液制備的微孔板和加速抗原抗體反應的酶標抗體稀釋液，使一步法反應快速、充分，從而達到快速、高靈敏度、特異性好級量程寬的目的。
[0016]本發明試劑盒使用特異性的抗體和抗原，從而能夠將PG I和PG II兩個項目整合到一個檢測試劑盒，使得除微孔板外所有試劑組分都整合后通用，所以一個試劑盒可同時檢測PG I和PG II兩個項目，操作簡單，檢測快速，便于臨床使用；本發明試劑盒靈敏度高，檢測靈敏度達0.1 μ g/L ;量程寬，檢測樣本不需要稀釋；檢測時間短，整個檢測時間為I小時，比現有市場上同類產品檢測時間縮短45-60分鐘；檢測樣本需求量少，一次上樣只需要50 μ 1，比目前市場上同類產品上樣量減少一倍。
【附圖說明】
[0017]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中: 圖1為胃蛋白酶原PG I的標準曲線；
圖2為胃蛋白酶原PG II的標準曲線。
【具體實施方式】
[0018]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。
[0019]實施例1
本發明的胃蛋白酶原I / II聯合檢測試劑盒由以下組分組成:
1、包被抗PG I抗體的微孔板，制備方法如下:
(1)抗PGI抗體的制備:將PG I抗原部分基因序列PG 1-A和PG 1-B分別通過基因工程克隆表達得到PG 1-A和PG 1-B重組蛋白，并利用克隆表達的重組蛋白免疫小鼠制備得到單克隆抗體；PG 1-A的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.1, PG 1-B的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2 ;兩條核苷酸序列分別按照上述方法制備得到單克隆抗體后，以1:1的質量比混合；
(2)抗PGI抗體的包被:用包被機或移液器將包被緩沖液按100 μ I/孔加入微孔板；用蓋板膜封閉微孔板，放置于4°C冰箱過夜；用稀釋后的0.05M洗滌液洗板5次。其中，包被緩沖液為:0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6);包被濃度為5μ g/ml ；
(3)抗PGI抗體的封閉:用包被機或移液器將封閉液按300 μ I/孔加入微孔板；蓋板膜封閉微孔板，放置于37°C封閉I小時；用稀釋后的0.05M洗漆液洗板5次。其中,封閉液為:0.2M磷酸鹽緩沖液，1%BSA, 2%酪蛋白(ρΗ7.4)；
(4)真空包裝:將上述處理后的微孔板放置于37°C烘箱干燥0.5小時；立即用真空封裝機進行真空包裝。
[0020]2、包被抗PG II抗體的微孔板，制備方法如下:
(1)抗PGII抗體的制備:將PG II抗原的全部基因序列通過基因工程克隆表達得到PG II重組蛋白，并利用克隆表達的PG II重組蛋白免疫小鼠制備得到單克隆抗體，PG II抗原的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.3 ；
(2)抗PGII抗體的包被:用包被機或移液器將包被緩沖液按100 μ I/孔加入微孔板；用蓋板膜封閉微孔板，放置于4°C冰箱過夜；用稀釋后的0.05M洗滌液洗板5次。其中，包被緩沖液為:0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6);包被濃度為5μ g/ml ；
(3)抗PGII抗體的封閉:用包被機或移液器將封閉液按300 μ I/孔加入微孔板；蓋板膜封閉微孔板，放置于37°C封閉I小時；用稀釋后的0.05M洗漆液洗板5次。其中,封閉液為:0.2M磷酸鹽緩沖液，1%BSA, 2.0%酪蛋白(ρΗ7.4)；
(4)真空包裝:將上述處理后的微孔板放置于37°C烘箱干燥0.5小時；立即用真空封裝機進行真空包裝。
[0021]3、酶標抗體:PG 1-A、PG 1-B和PG II的單克隆抗體，標記的酶為辣根過氧化物酶；PG 1-A的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.1, PG 1-B的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2 ；PG II為PG II抗原的全部基因序列，具體參見SEQ ID N0.3。
[0022]4、酶標抗體稀釋液:0.1M Tris鹽酸緩沖液，0.1%_1%BSA，0.5%_2.0%酪蛋白，l%-6% (NH4) 2S04,1%-5%SDS, 0.1%-1% 甘油，0.01%-0.1%DDT，5-10% 蔗糖，ρΗ8.5 ；
通過對酶標抗體稀釋液配方的優化，能夠加速抗原抗體反應，從而縮短檢測時間。
[0023]5、校準品JfPG I抗原部分基因序列(PG I抗原部分基因序列為PG 1-A和PG 1-B, PG 1-A的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.1，PG 1-B的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2)和PG II抗原全部基因序列(參見SEQ ID N0.3)通過基因工程克隆表達得到的PG I和PG II重組蛋白JfPG 1-A,PG 1-B和PG II按照一定比例混合并用校準品稀釋液稀釋，配制成以下濃度的校準品:
校準品濃度范圍=PG I為0-90 μ g/L, PG II為0-48 μ g/L ;具體為:
校準品 I:(PG 1-A:0.0 μ g/L、PG 1-B:0.0 μ g/L、PG I1:0.0 μ g/L)
校準品 2: (PG 1-A:15.0 μ g/L、PG 1-B: 15.0 μ g/L, PG I1:6.0 μ g/L)
校準品 3: (PG 1-A:35.0 μ g/L、PG 1-B:35.0 μ g/L、PG I1:12.0 μ g/L)
校準品 4: (PG 1-A:60.0 μ g/L、PG 1-B:60.0 μ g/L、PG I1:24.0 μ g/L)
校準品 5: (PG 1-A:90.0 μ g/L、PG 1-B:90.0 μ g/L、PG I1:48.0 μ g/L)
其中，校準品稀釋液為:0.1M PBS, ρΗ7.4。
[0024]6、質控品JfPG I抗原部分基因序列(PG I抗原部分基因序列為PG 1-A和PG 1-B, PG 1-A的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.1，PG 1-B的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2)和PG II抗原全部基因序列(參見SEQ ID N0.3)通過基因工程克隆表達得到的PG I和PG II重組蛋白JfPG 1-A, PG 1-B和PG II按照比例混合，用校準品稀釋液稀釋得到質控品，質控品中各組分濃度為=PG 1-A:30.0 μ g/L, PG 1-B:30.0 μ g/L、PG I1:16.0 μ g/L。
[0025]7、底物液:0.2mg/ml 過氧化脲，0.1M 檸檬酸緩沖液 ρΗ5.5，TMB 0.5mg/ml，0.1%DMSO。
[0026]8、終止液:2M硫酸。
[0027]9、濃縮洗滌液:0.5M磷酸鹽緩沖液，1.8%十二烷基硫酸鈉，pH7.4。
[0028]10、說明書
本發明的試劑盒的檢測方法