檢測乙肝病毒表面抗原的試劑盒及其檢測方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及體外診斷檢測技術領域，特別是涉及一種檢測乙肝病毒表面抗原的試 劑盒及其檢測方法和應用。
【背景技術】
[0002] 乙型病毒性肝炎（簡稱乙肝）是由乙型肝炎病毒（HBV)引起的、可導致肝臟炎性 病變，并能夠引起多器官損害的一種疾病。乙肝廣泛流行于世界各國，主要侵犯兒童及青壯 年，少數患者可轉化為肝硬化或肝癌。因此，它已成為嚴重威脅人類健康的世界性疾病，也 是我國當前流行最為廣泛、危害性最嚴重的一種疾病。
[0003] 乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒。是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科 (hepadnavividae)。乙肝病毒表面抗原（HBsAg)是乙肝病毒的外殼蛋白，其自身并不具有 傳染性，但它的出現常伴隨乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的標志。1976年10 月，世界衛生組織（WHO)專家會議規定了乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen) 統一縮寫為HBsAg。它的分子量為2. 4X1000000,是由混合的多肽組成，含有脂類、糖類和 蛋白質等。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、淚水、鼻咽分泌物、精液及陰道分泌物 中。在感染乙肝病毒后2~6個月，當丙氨酸氨基轉移酶升高前2~8周時，可在血清中測 到陽性結果。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期轉陰，慢性乙型肝炎患者該指標可持 續陽性。
[0004] 乙肝病毒的檢測通常包括以下方法：
[0005] 1.肝功能檢查：包括膽紅素、AST(谷草轉氨酶）、ALT(谷丙轉氨酶）、A/G(白蛋白 /球蛋白）等。
[0006] 2?血清學檢查：包括 HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc 等，即通常所 說的"乙肝兩對半"。有條件的還可以可檢測HBV-DNA，DNA-p，Pre-Sl、Pre-S2等，以及采用 原位雜交技術檢測肝內HBV-DNA。
[0007] 3?肝臟活檢（肝穿刺檢查）。
[0008] 4.血糖、尿糖、尿常規等。
[0009] 在上述檢測方法中，免疫血清學檢查具有方便、快捷和準確等優點，已經普遍應用 于醫療檢測和診斷領域。較常見的免疫血清學檢查方法有免疫熒光技術、放射免疫分析法 (RIA)、酶聯免疫吸附試驗（ELISA)、免疫膠金體技術及化學發光免疫分析等。乙肝血清學檢 測項目一般包括JffisAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc五項等，即所謂的"乙肝兩對 半
[0010] 其中，HBsAg的檢測方法常用的有酶聯免疫法、膠體金法、化學發光法等。酶聯免疫 法價格便宜，靈敏度高，是目前國內應用最多的方法，但酶聯免疫法只可以作為定性判斷， 且手工操作誤差較大，難以適應市場發展的需求。膠體金法的優點是及時、快速，適宜于現 場檢測，其特異性和靈敏度遠差于酶聯免疫法。化學發光法可用于定量測定，無論從方法學 和自動化程度看，都要優于酶聯免疫法。
[0011] 但是，常規技術中的乙肝體外診斷試劑存在對抗原濃度極高樣本測不準或靈敏度 不高的問題。
【發明內容】
[0012] 基于此，本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種檢測乙肝病毒表面抗 原的試劑盒及其檢測方法，采用該試劑盒和檢測方法來檢測乙肝病毒表面抗原，既能提高 樣本檢測的靈敏度，又不會測不準抗原濃度極高的樣本。
[0013] 為實現上述目的，本發明采取以下技術方案：
[0014] 一種檢測乙肝病毒表面抗原的試劑盒，包括以下組分：
[0015] 1)磁性微球體系：包括有直接連接或間接連接抗HBsAg抗體1的磁性微球；
[0016] 2)第一標記物體系：包括有直接連接或間接連接第一標記示蹤物或第二標記示 蹤物的抗HBsAg抗體2 ;
[0017] 3)第二標記物體系：包括有直接連接或間接連接第一標記示蹤物或第二標記示 蹤物的抗fffisAg抗體2,或者包括有直接連接或間接連接第一標記示蹤物或第二標記示蹤 物的抗HBsAg抗體3 ;
[0018] 所述抗HBsAg抗體1、抗HBsAg抗體2和抗HBsAg抗體3的抗體位點互不相同。
[0019] 上述"直接連接"為直接結合的連接，上述"間接連接"為通過生物素和鏈霉親和 素，或異硫氰酸熒光素和抗異硫氰酸熒光素抗體等能夠相互結合的搭橋物以間接結合的方 式連接。上述第一標記物體系和第二標記物體系中，既可以選用相同的標記物體系，也可選 用不相同的標記物體系。其中，不相同的標記物體系，既可以是其中標記示蹤物的濃度不 同，也可以是標記的標記示蹤物不同，或者是抗HBsAg抗體的抗體位點不同。所述抗體既可 以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。
[0020] 本發明人發現，常規技術中的乙肝體外診斷試劑存在測不準抗原濃度極高的樣 本，是由于采用的是一步法，即在加入包被抗體磁性微球的同時加入標記了標記示蹤物的 抗體，溫育反應結束后形成抗體-抗原-抗體的"三明治"復合物。但是，如樣本中抗原濃 度極高時會出現明顯的HOOK效應，即當樣本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和包 被抗體磁性微球及標記了標記示蹤物的抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低 于實際含量而導致出現HOOK效應。而對于靈敏度不高的問題，則是由于采用了兩步法，SP 在第一步加樣中，僅加入包被抗體磁性微球，使抗原充分和包被抗體磁性微球反應結合，清 洗后再第二步加樣，加入標記了標記示蹤物的抗體，形成抗體-抗原-抗體的"三明治"復 合物，但是，該兩步法的第一步加樣反應中，只是樣本中的抗原和包被抗體磁性微球反應， 沒有形成抗體-抗原-抗體結合的"三明治"復合物，因此在清洗過程中會損失掉一定的抗 原，造成檢測靈敏度的降低。
[0021] 在上述研宄發現的基礎上，本發明在常規一步法和兩步法的基礎上進行了改進， 在該試劑盒中設置第一標記物體系和第二標記物體系，使用該試劑盒檢測乙肝病毒表面抗 原時，首先進行一次加樣，將待測樣本與第一標記物體系和磁性微球體系混合，溫育反應后 清洗，再進行二次加樣，再次加入第二標記物體系，徹底形成抗體-抗原-抗體結合的雙抗 夾心復合物，再進行檢測，從而既避免了產生HOOK效應的問題，又避免了清洗過程中會損 失一定抗原，造成靈敏度下降的問題。
[0022] 適用于本發明的磁性微球也稱為磁珠或磁球，可以是本領域中常用的磁性微球。 優選的是，本發明使用的磁球，是將納米級的Fe 203或Fe 304磁性粒子和有機高分子材料進行 復合，形成具有超順磁性和極大量蛋白吸附容量的微米級的固相微球，具有在外加磁場作 用下可迅速被磁化，在撤走磁場后剩磁為零的屬性。其中，所述有機高分子材料的種類沒有 特別限制，可根據需要進行選擇。
[0023] 本發明所使用的磁性微球應能滿足直徑為0. 1-5 y m，磁性微球還可以通過表面改 性而帶有多種活性功能基團，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。
[0024] 在其中一個實施例中，所述磁性微球為Fe20 3或Fe 304磁性納米粒子與有機高分子 材料的復合體，并具有〇. 1-5 y m的粒徑，并且，所述磁性微球任選地通過表面改性而帶有 一種或多種活性功能基團。
[0025] 在上述技術方案中，磁性微球體系中，磁性微球的工作濃度優選0.lmg/ml-2mg/ ml，抗HBsAg抗體1的工作濃度優選1-20 y g/ml ;標記物體系中，第一標記示蹤物或第二標 記示蹤物的工作濃度優選5ng/ml-500ng/ml，抗HBsAg抗體2或抗HBsAg抗體3的工作濃度 優選50ng/ml-5000ng/ml。將各試劑成分的濃度設定在此范圍內，既能避免由于濃度過低導 致光信號低，影響試劑檢測的靈敏度；又能避免濃度過高所造成的成本浪費。可根據具體情 況調整。
[0026] 可以理解的，為了達到定量測定的目的，該試劑盒還可以包括HBsAg濃度優選 0. 05IU/ml-10IU/ml的校準品溶液和濃度優選100IU/ml-1000IU/ml的校準品溶液。
[0027] 同樣可以理解的，該試劑盒中的各組分均含有牛血清白蛋白（BSA)和防腐劑，BSA 的濃度為〇. 01-0. 5g/ml，防腐劑為山梨酸鉀、苯甲酸鈉、疊氮鈉、亞硝酸鈉、Proclin系列中 的任一種或兩種以上混合物。
[0028] 在其中一個實施例中，所述第一標記物體系和第二標記物體系中所用的標記示蹤 物相同。即均為第一標記示蹤物或均為第二標記示蹤物。采用相同的標記示蹤物，其發光 效率是一致的，能夠具有更好的檢測準確性。
[0029] 在其中一個實施例中，所述第一標記物體系中所用的抗HBsAg抗體，和第二標記 物體系中所用的抗HBsAg抗體相同。在標記示蹤物中采用相同的抗體，能夠確保抗原和標 記示蹤物之間結合的一一對應性，具有更好的檢測準確性。
[0030] 上述標記示蹤物包括以下幾種：1、化學發光免疫分析使用的能夠直接發光的標記 物，如魯米諾及其衍生物、異魯米諾或其衍生物、叮啶酯等；2、化學發光酶免疫分析使用的 配合相應底物可以發光的標記物，如堿性磷酸酶或過氧化物酶等。
[0031] 在其中一個實施例中，所述標記示蹤物為發光標記物，選自：金剛烷，魯米諾及其 衍生物，異魯米諾及其衍生物，叮啶酯。優選N-(4-氨基丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)，與 上述發光標記物配合的氧化系統包括H 202-微過氧化物酶、H202-過氧化氫酶、H20 2-乳過氧 化物酶、H202-次氯血紅素、H20 2-氯化血紅素、次氯酸鹽-C〇Cl2、過硫酸鹽、過氧化鉀、高碘酸 鈉、H 202-K3Fe (CN) 6、黃嘌呤-次黃嘌呤氧化酶、叔丁醇鉀中的至少一種。
[0032] 上述發光標記物是指在發光反應中參與能量轉移并最終以發射光子的形式釋放 能量的化合物，該化合物能夠經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發態的中間體， 當這種激發態中間體回到穩定的基態時，同時發射出光子（hM)。
[0033] 在其中一個實施例中，所述標記示蹤物為化學發光