一種阪崎腸桿菌檢測試劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種細菌檢測試劑及其制備方法，具體涉及一種用于檢測奶粉或牛奶 中阪崎腸桿菌的試劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii)是革蘭氏陰性菌，能運動，無芽孢且兼性厭 氧。以前一直被認為是黃色陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)到1980年才更名為"阪崎 腸桿菌"。2008年又將阪崎腸桿菌定義為腸桿菌的一個新屬一克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp) 〇
[0003] C. sakazakii是一種能夠在動物和人體內寄生的致病菌，能夠引起嚴重的新生兒 腦膜炎、壞死性小腸結腸炎及菌血癥，并能引起神經系統后遺癥甚至死亡。該菌感染引起的 死亡率高達50%以。近年來，對C. sakazakii在食品、飲品、加工原輔料、生態環境等多方面 的研宄發現其在自然界中分布廣泛。現階段還不能確定其具體的宿主和感染源，但發現嬰 兒配方奶粉是它的主要感染渠道。
[0004] 1961年Urmenyi和Franklin首次發現兩例由C. sakazakii引起的新生兒腦膜 炎以后從感染病人的感染部位、創傷部位和排泄物等中分離到C. sakazakii。第一個將 C. sakazakii與嬰幼兒配方奶粉聯系起來的是Muytjens，他們在研宄荷蘭的八例新生兒 髓膜炎和敗血癥時，從沖調奶粉的器具中分離出阪崎腸桿菌。之后，世界各地也多次發現 C. sakazakii污染的事件。冰島報道了三例嬰幼兒奶粉引起感染C. sakazakii的案例。2001 年田納西州的一個新生兒加護中心發生了十例C. sakazakii感染引起的腦膜炎，從同品牌 的同一批次嬰幼兒配方奶粉產品中培養到了 C. sakazakii，生產該奶粉的公司召回了這批 產品。2004年，我國安徽阜陽發生劣質奶粉引發的"大頭娃娃"事件，從87分阜陽劣質奶粉 樣品中檢測到十一例阪崎腸桿菌陽性樣品。這些研宄表明，奶粉中C. sakazakii是危害生 命安全和健康的重要生物因素之一。
[0005] 2011年4月出臺的《食品安全國家標準嬰兒配方食品》（GB 10765-2010)將 C. sakazakii納入檢測范圍。嬰兒配方奶粉生產線上阪崎腸桿菌的有效檢出對其風險控制 有著重要意義。因此，目前對簡便、快捷、特異性好、低成本的阪崎腸桿菌檢測方法的需求越 來越迫切。
【發明內容】
[0006] 本發明是為了解決現有的檢測阪崎腸桿菌的膠體金試紙條無法定量檢測的問題， 提供一種阪崎腸桿菌檢測試劑及其制備方法。
[0007] 本發明阪崎腸桿菌檢測試劑由試劑A和試劑B組成，其中所述試劑A包括緩沖液、 促凝劑、BSA和防腐劑；所述試劑B包括標記有抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的膠體金顆粒、穩 定劑、緩沖液和防腐劑；試劑A中緩沖液的濃度為20~50mmol/L，促凝劑的濃度為2% (w/ v)，BSA的濃度為2% (w/v)，防腐劑的濃度為0. 1 %~0. 5% (w/v);試劑B中緩沖液的濃 度為20~50mmol/L，標記有抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的膠體金顆粒的濃度為0. 08mg~0. 8mg/mL，穩定劑的濃度為2%~5% (w/v)，防腐劑的濃度為0. 1%~0. 5% (w/v)，所述試 劑A和試劑B的體積比為5:1。
[0008] 上述阪崎腸桿菌檢測試劑的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 一、將促凝劑、BSA和防腐劑加入到緩沖液中，制得試劑A ;
[0010] 二、將氯金酸與檸檬酸三鈉按照質量比1:1加熱煮沸制得膠體金溶液；將抗阪崎 腸桿菌多克隆抗體加入到膠體金溶液中，超濾，得到標記有抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的膠 體金顆粒，將穩定劑、防腐劑和緩沖液混合得混合液，然后將混合液與標記有抗阪崎腸桿菌 多克隆抗體的膠體金顆粒混合，制得試劑B ;
[0011] 三、將試劑A和試劑B按照5:1的體積比混合，即得抗阪崎腸桿菌檢測試劑。
[0012] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0013] 1、本發明利用膠體金勻相顆粒特性，將特定的抗阪崎腸桿菌多克隆抗體標記于膠 體金顆粒表面，當檢測系統或檢測環境中存在阪崎腸桿菌時，膠體金顆粒表面的抗體即將 與之對應的抗原捕獲，并形成抗原_抗體復合物，進而造成局部膠體金顆粒的聚合或堆積， 使膠體金勻相試劑透光光譜由紅色向藍色光譜移動，這種移動主要反應為540nm處吸光度 的降低和660nm處吸光度的升高，從而達到定量檢測檢體中阪崎腸桿菌的目的，同時避免 了同類檢測項目乳膠增強免疫比濁法試劑在反應后產生膠乳微球交聯物吸附比色杯不易 清洗的缺點。
[0014] 2、本發明檢測試劑中標記有抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的膠體金顆粒為納米金，顆 粒直徑為60nm~90nm，可以做到定量檢測。
[0015] 3、本發明可用于檢測乳粉或牛奶中阪崎腸桿菌含量，適用于乳品檢測過程中使用 的分光光度計、半自動生化分析儀和全自動生化分析儀等儀器。
[0016] 4、本發明檢測線性范圍大，可達IX 102~1X10 6cfu/mL，具有高分析靈敏度，高特 異性，使用方便且檢測快速等特點。
【附圖說明】
[0017] 圖1為實施例六中膠體金顆粒大小與其它不同顆粒大小的膠體金分析能力比較； 圖2為國標方法和本發明試劑檢測結果的比較。
【具體實施方式】
[0018] 本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。本發明中涉及的重量體積比記為"w/v"，單位為"g/mL"。
【具體實施方式】 [0019] 一：本實施方式阪崎腸桿菌檢測試劑由試劑A和試劑B組成，其中所 述試劑A包括緩沖液、促凝劑、BSA和防腐劑；所述試劑B包括標記有抗阪崎腸桿菌多克隆 抗體的膠體金顆粒、穩定劑、緩沖液和防腐劑；試劑A中緩沖液的濃度為20~50mmol/L，促 凝劑的濃度為2% (w/v)，BSA的濃度為2% (w/v)，防腐劑的濃度為0. 1%~0. 5% (w/v); 試劑B中緩沖液的濃度為20~50mmol/L，標記有抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的膠體金顆粒 的濃度為〇? 〇8mg~0? 8mg/mL，穩定劑的濃度為2%~5% (w/v)，防腐劑的濃度為0? 1%~ 0. 5 % (w/v)，所述試劑A和試劑B的體積比為5:1。
【具體實施方式】 [0020] 二：本實施方式與一不同的是：試劑A和試劑B中的 緩沖液均為含有〇. 5%~5. 0% (w/v)BSA的Tris-HCl緩沖液、HEPES緩沖液、硼酸鹽緩沖 液、甘氨酸緩沖液中的一種或幾種按任意比組成的混合物。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0021] 三：本實施方式與一或二不同的是：試劑A中的促凝 劑為PEG6000或Brij-35。其它與一或二相同。
【具體實施方式】 [0022] 四：本實施方式與一至三之一不同的是：試劑A和試 劑B中的防腐劑均為疊氮化鈉。其它與一至三之一相同。
【具體實施方式】 [0023] 五：本實施方式與一至四之一不同的是：試劑B中的 穩定劑為蔗糖或海藻糖。其它與一至四之一相同。
【具體實施方式】 [0024] 六：本實施方式與一至五之一不同的是：所述標記有 抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的膠體金顆粒的直徑為60nm~90nm，顆粒含量為0. 08~0. 8mg/ mL。其它與一至五之一相同。
【具體實施方式】 [0025] 七：本實施方式與一至五之一不同的是：所述標記有 抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的膠體金顆粒的直徑為75nm~85nm。其它與一至 五之一相同。
【具體實施方式】 [0026] 八：本實施方式與一至七之一不同的是：所述試劑A 和試劑B的pH值均為7. 0~9. 0。其它與一至七之一相同。
【具體實施方式】 [0027] 九：本實施方式與一至七之一不同的是：所述試劑A 和試劑B的pH值均為7. 8~8. 2。其它與一至七之一相同。
【具體實施方式】 [0028] 十：本實施方式與一至九之一不同的是：所述標記有 抗阪崎腸桿菌抗體為多克隆抗體。其它與一至九之一相同。
【具體實施方式】 [0029] ^^一 ：本實施方式阪崎腸桿菌檢測試劑的制備方法，包括如下步 驟：
[0030] 一、將促凝劑、BSA和防腐劑加入到緩沖液中，制得試劑A ;
[0031] 二、將氯金酸與檸檬酸三鈉按照質量比1:1加熱煮沸制得膠體金溶液；將抗阪崎 腸桿菌多克隆抗體加入到膠體金溶液中，超濾，得到標記有抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的膠 體金顆粒，將穩定劑、防腐劑和緩沖液混合得混合液，然后將混合液與標記有抗阪崎腸桿菌 多克隆抗體的膠體金顆粒混合，制得試劑B ;
[0032] 三、將試劑A和試劑B按照5:1的體積比混合，即得抗阪崎腸桿菌檢測試劑。
【具體實施方式】 [0033] 十二：本實施方式與^^一不同的是：試劑A中緩沖液 的濃度為20~50mmol/L，促凝劑的濃度為2% (w/v)，BSA的濃度為2% (w/v)，防腐劑的濃 度為0. 1%~0. 5% (w/v)。其它與^ 相同。
【具體實施方式】 [0034] 十三：本實施方式與^^一或十二不同的是：試劑B中 緩沖液的濃度為20~50mmol/L，標記有抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的膠體金顆粒的濃度為 0.08~0.811^/1]1匕穩定劑的濃度為2%~5%(￥八），防腐劑的濃度為0.1%~0.5%(￥/ v)。其它與十一或十二相同。
[0035]
【具體實施方式】十四：本實施方式與【具體實施方式】十一至十三之一不同的是：步驟 二所述膠體金溶液中抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的濃度為20~25 y g/mL。其它與具體實施 方式i 至十三之一相同。
【具體實施方式】 [0036] 十五：本實施方式與十一至十四之一不同的是：步驟 二所述膠體金溶液中抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的濃度為21~24 y g/mL。其它與具體實施 方式十一至十四之一相同。
【具體實施方式】 [0037] 十六：本實施方式與十一至十五之一不同的是：試劑 A和試劑B中的緩沖液均為含有0. 5%~5. 0% (w/v)BSA的Tris-HCl緩沖液、HEPES緩沖 液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或幾種按任意比組成的混合物。其它與具體實施 方式i 至十五之一相同。
【具體實施方式】 [0038] 十七：本實施方式與十一至十六之一不同的是：試劑 A中的促凝劑為PEG6000或Brij-35。其它與^^一至十六之一相同。
【具體實施方式】 [003