一種鉑基合金標記的三通道夾心型免疫傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于納米功能材料、免疫分析及生物傳感技術領域，具體涉及一種鉑基合金為標記物的三通道夾心型免疫傳感器制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]近年來，鉑基合金PtM的研宄得到了很大的發展，尤其作為低溫燃料電池的最佳催化劑，鉑基合金吸引了研宄者的廣泛興趣。與單一的Pt納米材料相比，摻雜其他金屬合金可以降低Pt的負載量，從而減少成本，同時還能保證催化劑活性不變，甚至使活性提高。在電化學傳感器的構建中，也常用到鉑基合金，如鉑金、鉑鈀、鉑銀雙金屬合金，或者鉑基三金屬合金。摻雜了其他貴金屬的合金，在一定程度上提高了催化活性，但成本高昂。而摻雜一些非貴金屬合金，利用Pt良好的生物相容性，以及另一種非貴金屬的電活性，可以從另一方面作為標記物構建電化學免疫傳感器。目前，多通道免疫傳感器制備中，大多利用量子點(CdS、ZnS等)、電子媒介體(二茂鐵、甲苯胺藍、普魯士藍、硫堇等)及負載不同金屬離子(Zn2+、Cd2+、Cu2+等)的納米材料作為標記物。而利用非貴金屬鉬基合金，如PtZn合金、PtCd合金、PtCu合金為標記物的三通道免疫傳感器還未出現。非貴金屬鉑基合金能夠作為信號標記物是因為隨著納米尺寸的減小，原子逐漸集中到材料表面，因此材料具有很強的電化學活性。此類鉑基合金的納米材料可以在醋酸-醋酸鈉緩沖液中產生很強的電信號，無需像采用鹽酸或硝酸來處理量子點進行洗脫，避免了繁瑣的操作步驟和酸對蛋白質分子的危害，減少測定誤差。
【發明內容】
[0003]本發明的目的之一是提供一種三通道夾心型免疫傳感器的制備方法。
[0004]本發明的目的之二是將所制備的三通道夾心型免疫傳感器，用于同時檢測三種分析物。
[0005]本發明的技術方案，包括以下步驟。
[0006]1.一種鉑基合金標記的三通道夾心型免疫傳感器的制備方法
(1)將玻碳電極依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化鋁粉末打磨拋光，然后用超純水沖洗，除掉表面的雜質，完成玻碳工作電極的預處理；
(2)將3~5μ L、1.0-3.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超聲處理分散均勻，然后滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干；
(3)依次將3~5μ?、8~12 Pg/mL分析物a的捕獲抗體、分析物b的捕獲抗體和分析物c的捕獲抗體，分別滴涂到工作電極表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂2~4PL、質量分數為1%的牛血清白蛋白于工作電極表面，置于4 °〇冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分別滴加不同濃度的分析物a、分析物b和分析物c于工作電極表面； (6)取3~5 μ?三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物，分別滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種鉑基合金標記的三通道夾心型免疫傳感器。
[0007]2.三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物的制備
(I)鉬基合金納米材料的制備
分別向三份已除氧超純水配制的50 mL、0.2~0.3 mmol/L梓檬酸水溶液中，依次加入0.05-0.15 mmol 的 H2PtCl4和 0.015-0.035 mmol 的氯化物溶液，氯化物選自 ZnCl 2或 CdCl2或CuCl2，再分別加入2 mmol的NaBH4,溶液產生大量氣泡，繼續攪拌2 h，制得黑色鉑基合金納米材料PtZn、PtCd和PtCu，用超純水清洗，干燥備用；
(2 )三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物的制備
稱取1.0-3.0 mg鉑基合金納米材料PtZruPtCd和PtCu，分散在0.5 mL、pH=7.4的PBS中，分別加入8~12 μ g的分析物a檢測抗體、分析物b檢測抗體和分析物c檢測抗體，4 °C下孵化12 h，制得三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物，通過離心分離除掉未結合的抗體后，將其分散在I mL、質量分數為0.1% BSA的PBS中，置于4 °0冰箱備用；
所述鉬基合金標記的分析物a檢測抗體孵化物為PtZn/a-Ab ；
所述鉬基合金標記的分析物b檢測抗體孵化物為PtCd/b-Ab ；
所述鉬基合金標記的分析物c檢測抗體孵化物為PtCu/c-Ab。
[0008]3.三種分析物的同時檢測步驟
(1)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的三通道夾心型免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 4.5-6.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中進行測試；
(2)用差分脈沖伏安對分析物進行檢測，掃描電壓根據所選鉑基合金納米材料在-1.2~0.2 V內選取，電位增量為0.004 V，振幅0.05 V，脈沖寬度0.2秒，采樣寬度0.0167秒，脈沖周期0.5秒；
(3)鉬基合金標記的分析物a檢測抗體孵化物PtZn/a-Ab發生氧化還原反應在-1.1V附近產生信號，鉑基合金標記的分析物b檢測抗體孵化物PtCd/b-Ab發生氧化還原反應在-0.75 V附近產生信號，鉑基合金標記的分析物c檢測抗體孵化物PtCu/c-Ab發生氧化還原反應在0.0 V附近產生信號，根據所得電流強度與分析物a、分析物b和分析物c之間的線性關系，繪制工作曲線。
[0009]4.所述分析物a、分析物b和分析物C，選自以下分析物中的任意三種:癌胚抗原CEA,甲胎蛋白 AFP，IgE, IgG,前列腺特異性抗原 PSA，CA 15-3, CA125，CA 19-9, CA724，CA242，鱗狀細胞癌抗原SCCA，組織多肽抗原TPA。
[0010]本發明的有益成果
(1)本發明首次將鉑基合金納米材料PtZn、PtCd和PtCu應用于三通道夾心型免疫傳感器的制備中，鉑基合金納米材料生物相容性好、導電性好、催化性能高，電活性強；
(2)基于PtZn、PtCd和PtCu等三種材料，用相同的修飾方法和檢測方法，利用抗原與抗體的特異性結合，選擇三種分析物的任意組合，即可實現高靈敏的同時檢測，顯著提高了檢測效率。
【具體實施方式】
[0011]實施例1 一種鉑基合金為標記物的三通道夾心型免疫傳感器制備方法
(1)將玻碳電極依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化鋁粉末打磨拋光，然后用超純水沖洗，除掉表面的雜質，完成玻碳工作電極的預處理；
(2)將3μ LU.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超聲處理分散均勻，然后滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干；
(3)依次將3μ?,8 Pg/mL分析物a的捕獲抗體、分析物b的捕獲抗體和分析物c的捕獲抗體，分別滴涂到工作電極表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂2PU質量分數為1%的牛血清白蛋白于工作電極表面，置于4 °C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分別滴加不同濃度的分析物a、分析物b和分析物c于工作電極表面；
(6)取3PL三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物，分別滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種鉑基合金標記的三通道夾心型免疫傳感器。
[0012]實施例2 —種鉑基合金為標記物的三通道夾心型免疫傳感器制備方法
(1)將玻碳電極依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化鋁粉末打磨拋光，然后用超純水沖洗，除掉表面的雜質，完成玻碳工作電極的預處理；
(2)將4yL、2.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超聲處理分散均勻，然后滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干；
(3)依次將4μ?、10 Pg/mL分析物a的捕獲抗體、分析物b的捕獲抗體和分析物c的捕獲抗體，分別滴涂到工作電極表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂3PU質量分數為1%的牛血清白蛋白于工作電極表面，置于4 °C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分別滴加不同濃度的分析物a、分析物b和分析物c于工作電極表面；
(6)取4PL三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物，分別滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種鉑基合金標記的三通道夾心型免疫傳感器。
[0013]實施例3 —種鉑基合金為標記物的三通道夾心型免疫傳感器制備方法
(1)將玻碳電極依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化鋁粉末打磨拋光，然后用超純水沖洗，除掉表面的雜質，完成玻碳工作電極的預處理；
(2)將5HU3.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超聲處理分散均勻，然后滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干；
(3)依次將5μ?Λ2 Pg/mL分析物a的捕獲抗體、分析物b的捕獲抗體和分析物c的捕獲抗體，分別滴涂到工作電極表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂4PU質量分數為1%的牛血清白蛋白于工作電極表面，置于4 °C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分別滴加不同濃度的分析物a、分析物b和分析物c于工作電極表面；
(6)取5PL三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物，分別滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種鉑基合金標記的三通道夾心型免疫傳感器。
[0014]實施例4三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物的制備 (I)鉬基合金納米材料的制備
分別向三份已除氧超純水配制的50 mL、0.2 mmol/L梓檬酸水溶液中，依次加入0.05mmol的H2PtClJP 0.015 mmol的氯化物溶液，氯化物選自ZnCl 2或CdCl 2或CuCl 2，再分別加入2 mmol的NaBH4,溶液產生大量氣泡，繼續攪拌2 h，制得黑色鉑基合金納米材料PtZn、PtCd和PtCu，用超純水清洗，干燥備用；
(2 )三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物的制備
稱取1.0 mg鉑基合金納米材料PtZn,PtCd和PtCu，分散在0.5 mL、pH=7.4的PBS中，分別加入8 μ g的分析物a檢測抗體、分析物b檢測抗體和分析物c檢測抗體，4 °C下孵化
12h，制得三種鉑基合金標記的分析物檢測抗體孵化物