高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法與裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于共焦顯微成像技術和質譜成像技術領域，將雙軸共焦顯微成像技術和質譜成像技術相結合，涉及一種高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法與裝置，可用于生物質譜的高分辨成像。
技術背景
[0002]質譜儀(Mass Spectrometry)是將樣品中的組分發生電離，使生成的不同荷質比的帶電原子、分子或分子碎片在電場和磁場的作用下分別聚焦而得到按質荷比大小順序排列的圖譜儀器。質譜成像是對樣品二維區域內多個微小區域分別進行質譜分析來檢測特定質荷比(m/z)物質的分布。
[0003]自上世紀80年代中期基質輔助激光解吸電離這種高靈敏度和高質量檢測范圍生物質譜成像技術的出現，開拓了質譜學一個嶄新的領域一生物質譜，促使質譜技術應用范圍擴展到生命科學研宄的眾多領域，特別是質譜在蛋白質、核酸、糖蛋白分析等方面的應用，不僅為生命科學研宄提供了新手段，而且也促進了質譜技術自身的發展。
[0004]但現有基質輔助激光解吸電離質譜儀存在以下突出問題:
[0005]I)由于利用簡單的激光聚焦來解吸電離樣品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、質譜探測空間分辨力不高等問題；
[0006]2)質譜成像所需時間長，激光質譜儀聚焦光斑軸向位置相對被測樣品常發生漂移冋題。
[0007]而生物樣品“微區”質譜信息的準確獲取對于生命科學研宄具有極其重要的意義。事實上，目前如何高靈敏地探測微區質譜信息是生物質譜領域亟待研宄的重要技術問題。
[0008]激光共焦顯微鏡“點照明”和“點探測”的成像探測機制，不僅使其橫向分辨力較同等參數的光學顯微鏡改善1.4倍，而且還使共焦顯微鏡極便于與超分辨光瞳濾波技術、徑向偏振光緊聚焦技術等結合來壓縮聚焦光斑，進一步實現高空間分辨顯微成像。
[0009]基于此，本發明提出一種高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法與裝置，其將激光雙軸共焦顯微鏡聚焦光斑的探測功能與激光聚焦解吸電離功能相融合，利用經超分辨技術處理的雙軸共焦顯微鏡的微小聚焦光斑對樣品進行高空間分辨成像，利用雙軸共焦顯微鏡同一聚焦光斑對樣品進行解吸電離供質譜探測系統進行成像，繼而實現被測樣品微區的高空間分辨圖像成像和高空間分辨質譜顯微成像。
[0010]本發明提出一種高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法與裝置可為生物質譜高分辨成像提供一個全新的有效技術途徑。
【發明內容】
[0011]本發明的目的是提高質譜成像的空間分辨力、抑制成像過程中聚焦光斑相對樣品的漂移，提出一種高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法與裝置，以期同時獲得被測樣品成分空間信息和功能信息。
[0012]本發明的目的是通過下述技術方案實現的。
[0013]本發明的一種高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法，其利用高空間分辨雙軸共焦顯微系統的聚焦光斑對樣品進行軸向定焦與成像，利用高空間分辨雙軸共焦顯微系統的同一聚焦光斑對樣品進行解吸電離來進行質譜成像，進而實現樣品微區圖像與組分的高空間分辨成像，包括以下步驟:
[0014]步驟一、使平行光束通過環形光發生系統后整形為環形光束，該環形光束再經測量物鏡聚焦到被測樣品上解吸電離產生等離子體羽；
[0015]步驟二、使計算機控制三維工作臺帶動被測樣品沿測量面法線方向在測量物鏡焦點附近上下移動，利用沿采集光軸放置的采集物鏡和強度點探測器對樣品反射測量光束進行聚焦探測得到雙軸共焦軸向強度曲線；
[0016]步驟三、將雙軸共焦軸向強度曲線沿z向平移s后得到移位雙軸共焦軸向強度曲線，然后將移位雙軸共焦軸向強度曲線與雙軸共焦軸向強度曲線相減處理得到錯位雙軸共焦軸向強度曲線；
[0017]步驟四、將錯位雙軸共焦軸向強度曲線的零點位置zA減去平移值s/2得(za-s/2)，計算機依據(za_s/2)值控制三維工作臺帶動被測樣品沿測量面法線方向運動，使測量物鏡的聚焦光斑聚焦到被測樣品上；
[0018]步驟五、利用電離樣品吸管將聚焦光斑解吸電離被測樣品產生的等離子體羽中的分子、原子和離子吸入質譜探測系統中進行質譜成像，測得對應聚焦光斑區域的質譜信息;
[0019]步驟六、利用由采集物鏡、聚焦透鏡、強度點探測器和三維工作臺構成的激光雙軸共焦探測系統對測量物鏡聚焦到被測樣品的微區進行成像，測得對應聚焦光斑區域的形態信息；
[0020]步驟七、計算機將激光雙軸共焦探測系統測得的激光聚焦微區形態信息與質譜探測系統同時測得的激光聚焦微區的質譜信息進行融合處理，繼而得到聚焦光斑微區的形態和質譜信息；
[0021]步驟八、計算機控制三維工作臺使測量物鏡對準被測樣品的下一個待測區域，然后按步驟二?步驟七進行操作，得到下一個待測聚焦區域的形態和質譜信息；
[0022]步驟九、重復步驟八直到被測樣品上的所有待測點均被測到，然后利用計算機進行處理即可得到被測樣品形態信息和質譜信息。
[0023]本發明高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法中，包括步驟一可為使平行光束通過矢量光束發生系統、光瞳濾波器后整形為環形光束，該環形光束再經測量物鏡聚焦到被測樣品上解吸電離產生等離子體羽。
[0024]本發明高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法中，包括步驟四可為計算機依據雙軸共焦軸向強度曲線最大值M對應的位置zB值來控制三維工作臺帶動被測樣品沿測量面法線方向運動，使測量物鏡的聚焦光斑聚焦到被測樣品上。
[0025]本發明的一種高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像裝置，包括點光源、沿入射光軸方向放置的準直透鏡、產生環形光束的環形光發生系統和聚焦光斑到被測樣品的測量物鏡，還包括沿采集光軸放置的用于探測測量物鏡聚焦光斑反射光強度信號的采集透鏡、聚焦透鏡和位于聚焦透鏡焦點的光強點探測器，以及用于探測測量物鏡聚焦光斑解吸電離的離子體羽組分的電離樣品吸管和質譜探測系統；入射光軸和采集光軸之間的夾角為
2Θ，并關于測量面法線對稱。
[0026]本發明的一種高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像裝置中，包括環形光發生系統可以用沿入射光軸方向放置的產生矢量光束的矢量光束發生系統和光瞳濾波器替代。
[0027]有益效果
[0028]本發明對比已有技術，具有以下優點:
[0029]I)將具有高空間分辨能力的雙軸共焦顯微技術與質譜探測技術相融合，使雙軸共焦顯微成像系統的光斑實現聚焦探測和樣品解吸電離雙重功能，可實現樣品微區質譜的高空間質譜顯微成像；
[0030]2)利用錯位相減雙軸共焦軸向強度曲線的過零點進行樣品預先定焦，使最小聚焦光斑聚焦到樣品表面，可實現樣品微區高空間分辨質譜探測和微區顯微成像，有效地發揮雙軸共焦系統高空間分辨的潛能；
[0031]3)利用錯位相減雙軸共焦軸向強度曲線過零點進行樣品預先定焦處理，可抑制現有質譜儀因長時間質譜成像中聚焦光斑相對被測樣品的漂移問題；
[0032]4)利用環形光束成像既壓縮了聚焦光斑的尺寸大小，又為質譜探測提供了結構方面的最佳融合，可提高激光質譜儀的空間分辨能力；
[0033]5)利用雙軸結構光束斜入射探測，克服了現有共焦顯微成像技術無法抑制焦面雜散光干擾的缺陷，抗雜散光能力強。
【附圖說明】
[0034]圖1為高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法示意圖
[0035]圖2為高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法變換示意圖
[0036]圖3為實施例1的高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像方法與裝置示意圖
[0037]其中:1-點光源，2-準直透鏡、3-平行光束、4-環形光發生系統、5-環形光束、6-測量物鏡、7-入射光軸、8-被測樣品、9-等離子體羽、10-采集光軸、11-采集透鏡、12-聚焦透鏡、13-雙軸共焦軸向強度曲線、14-移位雙軸共焦軸向強度曲線、15-錯位雙軸共焦軸向強度曲線、16-電離樣品吸管、17-質譜探測系統、18-計算機、19-強度點探測器、20-探測針孔、21-光強探測器、22-三維工作臺、23-測量面法線、24-矢量光束發生系統、25-光瞳濾波器、26-脈沖激光器、27-聚光透鏡、28-針孔、29-傳光光纖、30-出射光束衰減器、31-探測光束衰減器。
【具體實施方式】
[0038]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
[0039]本發明的核心方法如圖1所示，以下實施例均是在圖1基礎上實現的。
[0040]實施例1
[0041]本發明實施例基于圖3所示的高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像裝置，該裝置采用脈沖激光器26、聚光透鏡27和聚光透鏡27焦點處的傳光光纖29替代圖1中的點光源I。在圖3的激光聚焦系統中引入出射光束衰減器30，在激光雙軸共焦探測系統中引入探測光束衰減器31。
[0042]如圖3所示，高空間分辨激光雙軸共焦質譜顯微成像裝置包括點光源1，沿入射光軸7方向放置的準直透鏡2、出射光束衰減器30、環形光發生系統4、聚焦光斑到被測樣品8的測量物鏡6，還包括沿采集光軸10方向放置的用于探測測量物鏡6聚焦光斑反射光強度信號的采集透鏡11、聚焦透鏡12和位于聚焦透鏡12焦點的強度點探測器19，以及用于探測測量物鏡6聚焦光斑解吸電離的離子體羽9組分的電離樣品吸管16和質譜探測系統17，入射光軸7和采集光軸10之間的夾角為2 Θ，并關于測量面法線23對稱。其中，強度點探測器19可以由探測針孔20和光強探測器21構成。
[0043]主要構成的功能如下:
[004