生物原胺類神經遞質的前處理和檢測方法、及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于檢測技術領域，涉及一種生物原胺類神經遞質及代謝產物的前處理方 法、檢測方法、檢測試劑盒及用途。
【背景技術】
[0002] 生物原胺類神經遞質主要包括多巴胺（DA)、去甲腎上腺素（NE)、腎上腺素（E)、 5_羥色胺（5-HT)等，是人腦內神經元普遍存在的、十分重要的物質，在人體神經、心血管、 內分泌等組織系統起著廣泛的調節作用，對情緒、情感、應激行為、睡眠覺醒等生理活動有 重要影響。
[0003] 生物原胺類神經遞質及代謝產物的含量變化與多種疾病密切相關，是診斷嗜鉻細 胞瘤、阿爾茨海默氏癥、唐氏綜合征、抑郁癥和帕金森等疾病的重要依據。同時，生物原胺類 神經遞質還可用作診療性藥物，如去甲腎上腺素和腎上腺素是心肺復蘇的主要藥物、多巴 胺是重要的抗休克和治療急慢性腎功能衰竭的藥物。因此，生物樣品中生物原胺類神經遞 質及其代謝產物含量的準確測定對于疾病診斷和控制、藥物開發與治療及基礎醫學研究具 有重要意義。尤其在神經精神藥物研究領域，生物原胺類神經遞質含量測定的疾病診斷及 藥物療效評價作用更加突出。
[0004] 生物樣品中生物原胺類神經遞質及其代謝產物的含量很低，特別是代謝產物，其 含量通常僅達到pg/mL至ng/mL數量級，再加上生物原胺類神經遞質及其代謝產物的穩定 性差，在光照和堿性條件下容易發生氧化分解，這就進一步降低了生物樣品中生物原胺類 神經遞質及其代謝產物的含量；而且，生物原胺類神經遞質及其代謝產物的熒光響應和質 譜響應信號較弱；這就導致難以對生物樣品中生物原胺類神經遞質及其代謝產物的含量進 行準確檢測。
[0005] 早期采用電化學方法測定樣品中生物原胺類神經遞質的含量，但生物樣品基質復 雜，內源性物質和生物原胺類神經遞質之間、不同種生物原胺類神經遞質之間的干擾較多， 導致采用電化學方法測定含量存在極大困難。尤其對于大鼠微滲析樣品，由于其生物原胺 類神經遞質及代謝產物含量的很低，因此一直難以準確檢測。
[0006] 近來，生物原胺類神經遞質及其代謝產物的含量檢測取得了一些進展，包括采用 質譜進行檢測，質譜相比其他檢測儀器，靈敏度更高，并且能夠將內源性物質和生物原胺類 神經遞質之間、不同種生物原胺類神經遞質之間的干擾大幅降低。但生物原胺類神經遞質 及其代謝產物在質譜的反相色譜柱上保留極弱，且普遍含有的酚羥基使得離子化效率降 低，使得質譜響應信號減弱，制約了質譜檢測靈敏度的發揮。對于這一問題，目前的做法是 將生物原胺類神經遞質及其代謝產物中導致質譜信號減弱或穩定性降低的基團進行衍生 化處理，以提高檢測靈敏度。但衍生化處理的缺點是引入了高濃度的強酸或強堿鹽，這些鹽 類物質不僅會干擾質譜信號，而且對色譜柱乃至液質體系的壽命都會造成影響，因此必須 盡可能在檢測前去除這些鹽類物質。
[0007] 已有的液液萃取和離線固相萃取除鹽前處理技術，都需要在萃取后進行再濃縮， 這使得前處理變得步驟繁雜；而且，生物原胺類神經遞質及其代謝產物的穩定性差，濃縮等 方法會造成生物原胺類神經遞質的降解，回收率降低。
[0008] 目前尚須新的生物原胺類神經遞質及其代謝產物的前處理方法及檢測方法。
【發明內容】
[0009] 本發明給出一種生物原胺類神經遞質和/或其代謝產物的前處理方法，該前處理 方法能去除衍生化產生的鹽類、未反應的生物原胺類神經遞質原形雜質，減少雜質對檢測 造成的影響；同時能夠將衍生化產物快速洗脫并以適宜濃度轉移至后續檢測步驟。在此基 礎上，本發明還給出了生物原胺類神經遞質和/或其代謝產物的檢測方法，該方法能夠準 確、快速測定生物樣品中生物原胺類神經遞質和/或其代謝產物的含量、靈敏度高。并且， 避免了生物原胺類神經遞質及其代謝產物在測定處理過程中不穩定的問題。在此基礎上， 進而給出一種生物原胺類神經遞質和/或其代謝產物的檢測試劑盒。
[0010] 本發明一方面提供了一種生物原胺類神經遞質和/或其代謝產物的前處理方法， 包括將含有生物原胺類神經遞質和/或其代謝產物的樣品衍生化，以及將衍生化產物進行 在線固相萃取的步驟。
[0011] 本發明任一項實施方式中，所述前處理方法包含如下（1)-(9)的任意一項或者多 項：
[0012] (1)在線固相萃取的流動相為水和乙腈；
[0013] (2)在線固相萃取的富集階段，乙腈和水的體積比為（5-15) :(85-95)或（5-20): (80-95);具體為 5 :95、10 :90、15 :85 或 20 :80 ;
[0014] (3)在線固相萃取的轉移階段，乙腈和水的體積比為（85-100) :(0-15);具體為 85:15、90:10、95 :5 或 100:0 ;
[0015] (4)在線固相萃取的轉移階段，流動相的流速為0. 2-1. OmL/min ;
[0016] (5)在線固相萃取的柱活化階段，乙腈和水的體積比為（5-15) :(85-95)或 (5-20) : (80-95);具體為 5 :95、10:90、15 :85 或 20 :80 ;
[0017] (6)在線固相萃取流動相的洗脫程序為：乙腈5-15v/v% (0min，0. 2-lmL/min)- 乙臆 5_15v/v % (2-5min，0.2-1.0mL/min)-乙臆 85-lOOv/v % (5-8min，0.2-1.0mL/ min)-乙臆 85-lOOv/v% (8_12min，0.2-1. OmL/min)-乙臆 85-lOOv/v% (8. 5-12. 5min， 0· 2-1. OmL/min)-乙臆 85-100v/v % (9_13min，0· 2-1. OmL/min)-乙臆 5_15v/v % (9. 5-13. 5min, 0. 2-1. OmL/min)-乙臆 5-15v/v% (10. 5-14. 5min，0· 2-1. OmL/min)-乙臆 5-15v/v% (12. 5-16. 5min,0. 2-1. OmL/min)；
[0018] (7)在線固相萃取柱為SPE柱、預柱或色譜柱；
[0019] (8)在線固相萃取柱的填料為以硅膠和/或其修飾物為基質的封端或未封端的反 相碳十八、以硅膠和/或其修飾物為基質的封端或未封端的反相碳八、弱陽離子交換萃取 柱、強陽離子交換萃取柱、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱、氧化鋁萃取柱和HILIC萃取 柱中的一種或多種；
[0020] (9)在線固相萃取柱為美國 Thermo 公司的 Retain PEP Javelin, IOmmX 2. 1mm，或 者 HYPERSIL ODS 預柱，20 X 4mm，5 μ m。
[0021] 本發明任一項實施方式中，所述前處理方法包含如下（1)-(13)的任意一項或者 多項：
[0022] (1)衍生化是樣品與衍生化試劑反應；
[0023] (2)衍生化試劑的結構含有與芳環連接的磺酰氯基或酰氯基；具體地，還含與芳 環連接的胺基；更具體地，含對位或間位胺基；進一步具體地，胺基為伯胺、仲胺或者叔胺；
[0024] (3)衍生化試劑為2-氯苯磺酰氯、3-氯苯磺酰氯、4_(氯磺酰）異氰酸苯酯、 4-氯苯磺酰氯、苯磺酰氯、2, 3, 4-三氟苯磺酰氯、2, 3-二氯苯磺酰氯、2, 4, 5-三氯苯磺酰 氯、2, 4, 6-三氯苯磺酰氯、2, 4-二氟苯磺酰氯、2, 4-二溴苯磺酰氯、2, 4-二硝基苯磺酰氯、 2, 5-二氟苯磺酰氯、2, 5-二氯苯磺酰氯、2, 5-二溴苯磺酰氯、2, 6-二氟苯磺酰氯、2-(三 氟甲基）苯磺酰氯、2-氟苯磺酰氯、2-氯-4-(三氟甲基）苯磺酰氯、2-氯-4-氟苯磺酰 氯、2-氯-4-氰基苯磺酰氯、2-氰基苯磺酰氯、2-溴-4, 6-二氟苯磺酰氯、2-溴苯磺酰氯、 2_溴-4-氟苯磺酰氯、2-甲基-5-硝基苯磺酰氯、2-硝基苯磺酰氯、3, 4, 5-三氟苯磺酰氯、 3, 4-二氟苯磺酰氯、3, 4-二氯苯磺酰氯、3, 5-二氟苯磺酰氯、3, 5-二氯-2-羥基苯磺酰 氯、3, 5-二氯苯磺酰氯、3, 5-二甲基苯磺酰氯、3-(三氟甲基）苯磺酰氯、3-氟-4-甲基苯 磺酰氯、3_氟苯磺酰氯、3-氯-2-氟苯磺酰氯、3-氯-4-甲基苯磺酰氯、3-氰基-4-氟苯 磺酰氯、3-氰基苯磺酰氯、3-溴苯磺酰氯、3-甲氧基苯磺酰氯、3-硝基苯磺酰氯、4, 4' -亞 甲基雙（苯磺酰氯）、4-(三氟甲基）苯磺酰氯、4-(溴甲基）苯磺酰氯、4-(甲磺酰）苯磺 酰氯、4-乙酰基苯磺酰氯、4-叔丁基苯磺酰氯、4-異丙基苯磺酰氯、4-氟-2-甲基苯磺酰 氯、4_氟苯磺酰氯、4-氯-2-硝基苯磺酰氯、4-氯-3-硝基苯磺酰氯、4-氰基苯磺酰氯、 4-溴-2, 5-二氟苯磺酰氯、4-溴-2, 6-二氯苯磺酰氯、4-溴-2-氟苯磺酰氯、4-溴-2-氯 苯磺酰氯、4-溴-3-氟苯磺酰氯、4-溴-3-甲基苯磺酰氯、4-溴苯磺酰氯、4-甲基-3-硝 基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-硝基苯磺酰氯、4-碘苯磺酰氯、 4- 苯氧基苯磺酰氯、5-氟-2-甲基苯磺酰氯、5-氯-2-氟苯磺酰氯、五氟苯磺酰氯、五甲基 苯磺酰氯、2, 4, 6-三異丙基苯磺酰氯、2, 4-二甲氧基苯磺酰氯、2, 5-二甲氧基苯磺酰氯、 2, 5-雙（三氟甲基）苯磺酰氯、2-(三氟甲氧基）苯磺酰氯、2-溴-4-(三氟甲基）苯磺酰 氯、2-溴_5_(二氟甲基）苯磺酰氯、2-甲氧基-4-硝基苯磺酰氯、2-硝基_4_(二氟甲基） 苯