檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒和檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及的是，檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的，以母豬發熱、厭食和流產、死產、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道征狀和高死亡率為特征。該病1987年首次爆發于美國后，迅速蔓延至全球所有養豬國家和地區，給養豬業造成了巨大的經濟損失。因此，建立快速簡便的方法來對病毒進行檢測已成為該病檢測的迫切需要。
[0003]現有的檢測方法有病毒分離鑒定、免疫熒光試驗、PCR等常規技術，但病毒分離及免疫熒光試驗存在敏感性差、耗時長等不足；PCR診斷因其操作相對繁瑣、對實驗場地和實驗人員要求較高，不適于基層單位開展工作。
[0004]因此，現有技術沒有檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的有效工具。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒和檢測方法，從而提供一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測工具和方法。
[0006]本發明的技術方案如下:
一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ELISA試劑盒，其盒體內設置酶聯反應板、酶標結合物、濃縮洗滌液、底物液、顯色液、濃縮樣品稀釋液、終止液；其中，所述酶聯反應板包被了抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體；所述酶標結合物為辣根過氧化物酶標記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體的酶標結合物。
[0007]所述的ELISA試劑盒，其中，所述酶聯反應板是在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體，然后在4°C靜置12?24小時，冷凍真空干燥后裝袋封口制成；其中，所述抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體是用重組N蛋白免疫實驗動物后，所得抗血清或腹水經蛋白A柱純化后獲得；包被液為10 μ g/ml抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體的緩沖液，所述緩沖液是0.01mol/L?0.15 mo I/L的磷酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽緩沖液，PH7.5?pH9.5。
[0008]所述的ELISA試劑盒，其中，所述酶標結合物為用重組N蛋白免疫實驗動物后，所制得的抗體采用辣根過氧化物酶進行免疫標記制成。
[0009]所述的ELISA試劑盒，其中，所述酶標結合物是含0.05%?1%的辣根過氧化物酶標記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體的0.01mol/L?0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6?8 ;并且添加含量足以抑制細菌生長的防腐劑。
[0010]所述的ELISA試劑盒，其中，其還至少包括陰性對照品、陽性對照品其中之一。[0011 ] 所述的ELISA試劑盒，其中，所述洗滌液為包含有0.1%?1%表面活性劑的
0.01mol/L?0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6?8 ;底物液為0.1%?0.5%過氧化氫溶液；顯色劑為3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺；樣品稀釋液為0.01mol/L?0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6?8 ;終止液為I mol/L?2 mol/L的硫酸或氫氧化鈉。
[0012]一種用于所述的ELISA試劑盒的檢測方法，其包括步驟:
Al、用重組N蛋白免疫實驗動物后，所得抗血清或腹水經蛋白A柱純化，獲得抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體，在通用聚苯乙烯微孔板上包被所述抗體，然后在4°C靜置12?24小時，冷凍真空干燥后制成酶聯反應板，并裝袋封口保存；其中，包被液是含有
0.01%~1%所述抗體的緩沖液，所述緩沖液是ρΗ7.5?ρΗ9.5的0.01 mol/L?0.15 mol/L的磷酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽緩沖液；
A2、用重組N蛋白免疫實驗動物后，所制得的抗體采用辣根過氧化物酶進行免疫標記制成酶標結合物；
A3、所述酶聯反應板每孔分別加工作濃度的樣品稀釋液50 μ 1，再加入待檢的樣本50ul，混勻；其中，所述樣品稀釋液為0.01mol/L?0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6?8 ;
A4、充分反應后甩去孔內液體，每孔注滿(若用洗板機每孔加250 μ I)工作濃度洗滌液洗滌6次，每次均需停留I分鐘；最后一次甩凈，拍干；其中，所述洗滌液為包含有0.1%?1%表面活性劑的0.01mol/L?0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6?8 ;
A5、每孔加酶標結合物100 μ 1，充分反應后甩去孔內液體，每孔注滿(若用洗板機每孔加250 μ I)工作濃度洗滌液洗滌3次，每次均需停留I分鐘；最后一次甩凈，拍干；
Α6、按所需用量，臨用前取等體積底物液和顯色液充分混勻后每孔加100 μ 1，蓋好封板膜，充分顯色反應后加終止液50 μ 1，混勻，終止反應；其中，所述底物液為0.1%?0.5%過氧化氫溶液；所述顯色劑為3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺；所述終止液為I mol/L?2 mol/L的硫酸或氫氧化鈉。
[0013]所述的檢測方法，其中，步驟A3中，還包括步驟:設置陰性孔、陽性孔及空白對照孔，陰性孔、陽性孔分別加工作濃度的樣品稀釋液50 μ 1，然后分別加入陰性對照品、陽性對照品各50 μ 1，空白對照孔加入工作濃度的樣品稀釋液100 μ I。
[0014]所述的檢測方法，其中，所述充分反應為37°C避光反應30-60分鐘，所述充分顯色反應為37 °C避光反應15分鐘。
[0015]所述的檢測方法，其中，步驟Al中，在4°C靜置12?24小時之后，還包括步驟:采用0.1%?5%卵清蛋白或牛血清白蛋白封閉2小時，經冷凍真空干燥后制成所述酶聯反應板。
[0016]采用上述方案，采用本發明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測盒，開辟豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測的新途徑，利用快速免疫檢測技術的敏感性、特異性以及實用性、經濟性，建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒快速免疫檢測方法；實現了豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測技術商品化，有力促進豬繁殖與呼吸綜合征病毒監測水平的全面提高，推動了豬繁殖與呼吸綜合征病毒防控工作。這不僅大大方便了用戶操作，而且還提高了檢測指標的一致性，實用性和可靠性均得到改善。
【附圖說明】
[0017]圖1是本發明產品的結構示意圖；
圖2是本發明方法的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0018]以下對本發明的較佳實施例加以詳細說明。
[0019]如圖1所示，本發明提供了一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ELISA試劑盒，其盒體內設置酶聯反應板101和各種試劑102，各種試劑具體包括酶標結合物、濃縮洗滌液、底物液、顯色液、濃縮樣品稀釋液、終止液等等；其中，所述酶聯反應板為包被了抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體所制得的酶聯反應板；所述酶標結合物為辣根過氧化物酶標記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體的酶標結合物。
[0020]以下對本發明試劑盒的酶聯反應板和各種試劑進行詳細說明。
[0021]所述酶聯反應板是在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的抗體，其中抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，下面以多克隆抗體為例進行說明，但顯然對于單克隆抗體同樣可實現本發明的目的，然后在4°C靜置12?24小時，冷凍真空干燥后裝袋封口制成。在4°C靜置12?24小時之后，還可以采用0.1%?5%卵清蛋白或牛血清白蛋白封閉2小時，然后再冷凍真空干燥后裝袋封口制成所述酶聯反應板。其中，通用聚苯乙烯微孔板，可以是48孔板或96孔板，或其他板；所