一種酶納米復合物及其可控自組裝方法和在免疫分析中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫分析領域，特別涉及一種酶納米復合物及其可控自組裝方法和復 合物在免疫分析中的應用。
【背景技術】
[0002] 酶聯免疫分析（Enzyme-Linked TmmunoSorbent Assay, ELISA)是臨床、科研中應 用廣泛的特異性目標分子分析方法，其主要通過抗原-抗體分子間的特異性識別和酶分子 的高效催化來實現對復雜混合物中目標分子的檢測，傳統的ELISA方法，通過在抗體分子 上進行酶分子修飾來進行信號輸出，通常是一對抗原抗體復合物對應一個酶分子，檢測范 圍在0. lng/ml-100ng/ml之間。隨著技術的發展，該靈敏度已經不能夠滿足臨床檢測和科 學研究中的需求，因此亟需發展新型的高靈敏分析方法。
[0003] 目前，現有技術為了增加檢測靈敏度，常見的方法是增加修飾的酶分子的數量從 而提高檢測靈敏度。主要包括以下幾種方法：
[0004] 1.層層自組裝生物素化蛋白網絡，例如現有技術"Layer by layer assembly of biotinylated protein networks for signal amplification"，Chem. Commun.，2013, 49, 2397,該技術通過多生物素標記的蛋白分子與親和素反復的結合形成大 的復合物，從而使生物素增多，結合大量親和素修飾的酶分子，提高免疫分析靈敏度。但是， 該方法存在步驟多，檢測時間長，復合物表面酶分子數量不可控等問題，會造成信號不穩定 或者批次間操作的差異等問題。
[0005] 2.酶信號循環放大法，例如現有技術CN 102809648 A公開了一種酶信號循環放 大高靈敏免疫檢測方法，該方法主要是通過使用抗HRP的抗體與HRP交聯，兩者間相互結合 形成大的酶分子復合物，來提高靈敏度。然而該方法交聯會破壞HRP或抗體的活性，相互結 合形成大團復合物后，尺寸、酶分子數量完全不可控，會造成信號輸出不穩定等問題，而且 制備過程復雜。
[0006] 3.納米自組裝法，如現有技術"Seeding-induced self-assembling protein nanowires dramatically increase the sensitivity of immunoassaysNano Lett. 9(6):2246-50. 2009 An auto-biotinylated bifunctional protein nanowire for ultra-sensitive molecular biosensing. Biosens Bioelectron，'，26 (4) : 1137-41. 2010。 納米自組裝方法是通過自組裝的方法將酶分子和特異性結合分子整合在蛋白納米線上，提 高最終結合在抗原-抗體復合物上的酶分子數量，提高檢測靈敏度。但是該方法也存在制 備不可控的問題，酶分子數量不確定，最終導致信號不穩定，無法應用于定量檢測。且制備 過程繁瑣、成本高。
[0007] 4.納米管、納米顆粒法，在納米材料（如金納米顆粒、碳納米管等）上修飾酶分子 和抗體分子，通過提高酶分子數量來提高檢測靈敏度的。但是該方法中修飾過程不可控，會 導致蛋白分子功能失活，修飾數量和質量難以控制，批次間重現性差。
【發明內容】
[0008] 本發明為了克服現有技術酶分子數量不可控、重現性差、信號不穩定等缺點，提供 了一種酶納米復合物及其可控自組裝方法，復合物所含有的酶分子數量基本一致，并且通 過調整組裝比例，可以得到具有不同酶分子數量的酶納米復合物。
[0009] 為了實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：
[0010] 本發明提供一種酶納米復合物，包括位于核心層的納米顆粒，位于中間層的生物 素及位于外層的親和素修飾的酶；其中所述納米顆粒為由M個相同或同源的亞基通過自 組裝形成的球形納米顆粒，每個納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接M個生物素，所述 M彡12,且M為整數。
[0011] 優選的，酶納米復合物（簡稱ENC)中所含有的酶分子數量可通過以下公式進行簡 略計算：
[0012] X = nXM-iXn/2
[0013] 其中，X代表ENC中酶分子的數量，M代表納米顆粒的亞基數目，η代表ENC中所整 合的生物素化的蛋白納米顆粒（簡稱NP)的數量，i代表每個NP與相鄰顆粒共享的親和素 修飾的酶分子的數量。
[0014] 優選的，所述納米顆粒為蛋白納米顆粒；本領域技術人員知曉，所述納米顆粒還可 為病毒納米顆粒。更為優選的，所述納米顆粒為鐵蛋白納米顆粒，其中，每個鐵蛋白納米顆 粒通過遺傳修飾表面均勻連接24個生物素。本領域技術人員知曉，鐵蛋白納米顆粒還可為 小鐵蛋白，其中，每個小鐵蛋白納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接12個生物素。
[0015] 優選的，所述酶納米復合物為單體，其中，所述單體表面修飾有M個酶分子。更為 優選的，所述單體表面修飾有24個酶分子。
[0016] 優選的，所述酶納米復合物為多聚體；優選的，所述多聚體可為二聚體至十聚體 (包括二、三、四、五、六、七、八、九、十聚體），更為優選的，所述多聚體可為二聚體、三聚體 或四聚體。當所述酶納米復合物為二聚體時，兩個納米顆粒共用一個生物素，當納米顆粒為 鐵蛋白納米顆粒時，二聚體表面修飾有47個酶分子；當復合物為三聚體時，當納米顆粒為 鐵蛋白納米顆粒時，三聚體表面修飾有69個酶分子；當復合物為四聚體，納米顆粒為鐵蛋 白納米顆粒時，四聚體表面修飾有92個酶分子。依次類推，隨著共用的生物素數量的增加， 形成包括更多酶分子的多聚體。
[0017] 優選的，所述每個納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接M個生物素包括：
[0018] 通過分子克隆在所述納米顆粒亞基的N末端融合生物素接受多肽（biotin accepted peptide, BAP)得到融合蛋白基因，將所述融合蛋白基因克隆入表達載體；
[0019] 將生物素蛋白連接酶（Biotin-protein ligase, BirA)克隆入共表達載體中；
[0020] 將所述表達載體、共表達載體轉入表達宿主中培養，活化至對數生長期后加入誘 導表白蛋白和生物素；
[0021 ] 經破碎、純化后制得生物素化的納米顆粒。
[0022] 優選的，所述納米顆粒為鐵蛋白納米顆粒，鐵蛋白包括24個相同或同源的 亞基；更為優選的，鐵蛋白為重組人重鏈鐵蛋白（recombinant human heavy-chain ferritin, rHF)〇
[0023] 優選的，通過分子克隆在所述納米顆粒亞基的N末端融合連接多肽之后再融合生 物素接受多肽得到融合蛋白基因。減少可能存在的位阻的影響，保持生物素接受多肽遠離 納米顆粒的表面。
[0024] 優選的，所述表達載體和所述共表達載體為質粒載體，所述表達宿主選自大腸桿 菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、棒狀桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母或哺乳動物細胞。更為優 選的，所述表達載體為pET-28、pET-32、pET-15或pET-11，所述共表達載體為pCDFDuel-1， 所述表達宿主為大腸桿菌。
[0025] 優選的，所述克隆通過鏈式酶聚合反應（PCR)完成。
[0026] 優選的，將生物素蛋白連接酶（BirA)克隆入共表達載體中具體包括：獲取BirA基 因的核苷酸序列，設計引物，在上、下游引物中分別加入限制性內切酶NcoI和Sail的酶切 位點，通過PCR擴增BirA基因；將PCR產物BirA和表達載體p⑶FDuel-I進行雙酶切反應， 收集酶切產物；將收集到的酶切產物BirA和p⑶FDuel-I載體按物質的量比以6 :1進行連 接反應，得到 BirA-pCDFDuel-1。
[0027] 優選的，將所述表達載體、共表達載體轉入表達宿主中培養，活化至對數生長期后 加入誘導表白蛋白和生物素具體包括：將表達載體和共表達載體加入含有表達宿主和抗生 素的培養基中培養過夜，直至活化至對數生長期，加入IPTG誘導表白蛋白和生物素過夜， 進行培養和表達。
[0028] 優選的，經破碎、純化后制得生物素化的納米顆粒具體包括：收集表達后的產物進 行超聲破粹，收集上清液，水浴反應后離心，收集上清液利用蔗糖密度梯度離心或凝膠排阻 層析收集納米顆粒。
[0029] 優選的，所述酶為辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶或堿性磷酸酶。
[0030] 另一方面，本發明還提供一種酶納米復合物可控自組裝方法，通過遺傳修飾制備 生物素化的納米顆粒，將所述生物素化的納米顆粒與親和素修飾的酶混合，其中，所述納米 顆粒為由M個相同或同源的亞基通過自組裝形成的球形納米顆粒，