用于檢測腫瘤標志物muc1的電化學發光適配體傳感器的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種電化學發光適配體傳感器，尤其是涉及一種用于檢測腫瘤標志物 MUCl的電化學發光適配體傳感器的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 近年來全球癌癥發病狀況日趨嚴重，死于惡性腫瘤的患者逐年增多，能夠實現對 腫瘤的早期診斷和治療是降低死亡率的關鍵，目前癌癥的臨床診斷主要通過監測人體內腫 瘤標志物的含量實現。腫瘤標志物是指在腫瘤發生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身產生或 者由宿主對體內腫瘤反應而產生的一類生化物質,包括腫瘤相關蛋白類標志物、激素類標 志物、酶類標志物、基因類標志物和胚胎抗原等，可在腫瘤組織、血液、體液或排泄物中檢測 出來。
[0003]MUCl又名多態性上皮粘蛋白，是一種廣泛分布于機體各種粘膜表面的高分子量糖 蛋白。正常情況下MUCl主要表達于多種器官、組織上皮細胞的細胞膜胞膜頂端，呈頂端分 布或極性分布，但在多種腫瘤細胞中，MUCl的表達出現量和質的改變，并與腫瘤的浸潤、轉 移及預后相關，是一種非常有價值的腫瘤標志物。因此，簡單、快速、準確地檢測腫瘤標志物 MUC1，對多種癌癥的早期診斷及預后判斷具有重要意義。
[0004]目前，檢測腫瘤標志物MUCl的方法主要有放射免疫分析法、熒光免疫分析法、酶 聯免疫分析法和電化學免疫分析法等，這些方法都是基于抗原一抗體特異性結合反應，靈 敏度高、特異性強，但也存在一個共同的不足之處，即抗體難以獲得、成本高、穩定性差，除 此之外，上述方法或具有放射性危害、或操作過程繁瑣、或檢測成本偏高。因此，開發靈敏度 高、特異性強、簡單價廉于一體的分析方法，實現腫瘤標志物MUCl的快速檢測，仍是當前的 迫切需求。
[0005]核酸適配體是通過指數富集配體系統進化技術（SELEX)篩選出的、可通過折疊形 成特定空間結構與靶分子特異性結合的人工單鏈DNA或RNA序列，具有高特異性、高親和 性，被喻為"化學抗體"。作為分子識別體系，與抗體相比，核酸適配體的優越性是顯著的：① 抗體必須使用動物或者細胞系產生分子，而核酸適配體通過體外方法合成與分離；②核酸 適配體容易并且可重復合成，批次間的差異小，易于保存，穩定性、親和性和特異性均優于 抗體；③核酸適配體對溫度有高度的穩定性，而抗體是大蛋白分子，對溫度敏感，會產生不 可逆的變性。因此，核酸適配體在生物傳感與分析分離、核酸功能研究、核酸自組裝材料及 器件、疾病診斷與治療等研究領域，展現出廣闊的應用前景。
[0006]電化學發光（ECL)是對浸入含電化學發光物質的體系的電極施加一定電壓或者電 流而產生的化學發光現象，綜合了電化學和化學發光的優點，是一種靈敏度高、可視性強、 儀器簡單、可控性強、穩定性好、重現性好的分析方法。目前，國內外還沒有公開任何關于基 于磁性氧化石墨烯、電化學發光體和對腫瘤標志物MUCl具有特異性識別能力的核酸適配 體的用于檢測腫瘤標志物MUCl的電化學發光適配體傳感器的制備方法及其應用方面的相 關研究報道。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供一種組裝過程簡單，操作方法簡便，檢測結果 靈敏和準確性高、特異性強的用于檢測腫瘤標志物MUCl的電化學發光適配體傳感器的制 備方法及其應用。
[0008] 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種用于檢測腫瘤標志物MUCl 的電化學發光適配體傳感器的制備方法，包括以下步驟： (1) 多功能化氧化石墨烯材料的合成 a. 磁性氧化石墨烯的合成：在潔凈的三頸燒瓶中加入30~50mLImg/mL的氧化石 墨烯（G0)，超聲Ih;然后在氮氣氛保護下加入20~30mL0.05~0.07mol/L的氯化亞 鐵溶液和20~30mL0. 10~0. 15mol/L的氯化高鐵溶液，于70~90°C攪拌回流，同時 緩慢滴加10~15mL20%~30%的氨水至溶液的pH= 10~11，回流處理3~5h;冷卻 后，用二次水洗滌至溶液的pH= 7,定容到50mL，即得磁性氧化石墨烯材料溶液，4 °C儲存 備用； b. 取步驟（a)中所得的磁性氧化石墨烯材料溶液200UL于玻璃瓶中，超聲lh，然后 加入200~400iiL偶聯試劑，混合均勻，同時滴加稀鹽酸溶液至溶液pH= 4~6,振蕩孵 育Ih，二次水洗滌3次；再加入30~50iiL0. 001~0.Imol/L的電化學發光體溶液和 30~50iiL10~20iimol/L的適配體溶液，混合均勻，然后滴加氫氧化鈉溶液至溶液pH =8~10,振蕩孵育4h，二次水洗滌3次；加入質量百分濃度為1~2%的牛血清白蛋白溶 液100~200iiL，4°C下浸泡Ih，以封閉電極表面的非特異性活性位點，二次水洗滌3次， 定容至200yL，即可得到適配體和電化學發光體同時標記的多功能化氧化石墨烯材料溶 液，4 °C下儲存備用； (2) 電化學發光適配體傳感器的組裝 將直徑為3~5mm的磁性玻碳電極依次用L0iim、0. 3iim和0? 05iim的三氧化二 鋁漿拋光打磨，然后在乙醇和二次水中分別超聲2min，氮氣吹干；取5~10yL步驟（1) 中制備的多功能化氧化石墨烯材料溶液，滴涂到上述預處理過的磁性玻碳電極表面，多功 能化氧化石墨烯材料即被均勻、牢固地吸附到電極表面，即得電化學發光適配體傳感器。
[0009] 所述的電化學發光體溶液中溶質為魯米諾或N- (4-氨基丁基）-N-乙基異魯米諾， 溶劑為0.lmol/L氫氧化鈉溶液。
[0010] 所述的偶聯試劑為1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)與N-羥 基琥珀酰亞胺（NHS)溶于水中得到，所述的偶聯試劑中1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二 亞胺鹽酸鹽（EDC)的摩爾濃度為10~100mmol/L，所述的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)摩爾 濃度為1~10mm〇l/L。
[0011] 所述的適配體為氨基修飾的DNA片段，堿基序列為：5' -NH2-GCAGTTGATCCTTTGGAT ACCCTgg-S'。
[0012] 利用上述電化學發光適配體傳感器檢測腫瘤標志物MUCl的方法，具體步驟如下： 將上述制備的用于檢測腫瘤標志物MUCl的電化學發光適配體傳感器浸泡在不同濃度 的腫瘤標志物MUCl溶液中，37°C下溫育Ih，然后使用二次水輕輕洗滌后作為工作電極；使 用鉬絲電極作為對電極，Ag/AgCl電極或飽和甘汞電極作為參比電極，構成三電極體系；將 三電極體系置于緩沖溶液中，啟動電化學反應，測量體系的電化學發光強度值；獲得一系列 不同濃度的腫瘤標志物MUCl溶液對應的電化學發光強度值，建立電化學發光強度值與腫 瘤標志物MUCl濃度之間的定量關系；根據這個定量關系可以檢測待測樣品中腫瘤標志物 MUCl的濃度。
[0013] 所述的緩沖溶液為含有1~3mmol/LH2O2的0? 05mol/LpH= 9~11的 似2(：03-似11(：03體系緩沖溶液。
[0014] 電化學反應的條件如下：電位階躍計時電流法；脈沖寬度：0. 25秒；脈沖間隔：30 秒；初始電壓：〇V;脈沖電壓：1V。
[0015] 發明原理：多功能化氧化石墨烯材料是在氧化石墨烯上同時修飾有四氧化三鐵納 米磁珠、適配體和電化學發光體的復合材料，具有多種功能：（1)氧化石墨烯具有比表面積 大、表面官能團多和生物相容性好等優點，因此可以負載大量的四氧化三鐵納米磁珠、適配 體和電化學發光體；（2)四氧化三鐵納米磁珠不僅具有超強的磁性，使多功能化氧化石墨 烯材料均勻、牢固地吸附到電極表面，實現電化學發光適配體傳感器的一步組裝，簡化傳感 器的制備方法，同時還具有優良的導電性，增強多功能化氧化石墨烯材料的導電性，促進電 極表面的電子傳遞過程；（3)適配體對腫瘤標志物MUCl具有特異性的識別能力，可以特異 性地識別并捕獲溶液中的腫瘤標志物MUCl; (4)電化學發光體在電化學反應中可產生強而 穩定的電化學發光信號。
[0016] 本發明將多功能化氧化石墨烯材料滴涂到磁性玻碳電極表面后即可