采用壽命編碼的復合懸液分析/陣列的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明整體涉及復合分析和/或陣列；在一個實例中，更具體地涉及基于懸液的分析和/或陣列。換言之，本發明提供一種用于生物技術和生命科學實例領域的方法、系統和/或設備，如生物分子物種的確定和量化及防偽如防偽油墨或印刷。
【背景技術】
[0002]分子生物學前沿需要能夠同時確定和量化大量生物分子物種的高通量分析技術。這涵蓋基因組學、蛋白質組學、細胞間和分子信號、代謝組學、細胞組學和個體化用藥廣泛的生物信息學領域。例如，因為每個人的遺傳特征變化很大，且傳統的癥狀診斷技術經常無法診斷，新興個體化用藥領域致力于檢測個體基因表達譜，以將重點放在針對個體特定的治療上。現在，受分析速度和成本及基因組/蛋白質組的復雜性阻礙，目前無法更廣泛的采用這種個體化生物分子診斷。理想工具將是能夠支持不是幾十個而是數千個不同分子靶標的分析通道文庫或數據庫。
[0003]在數據存儲中，復合的主要目標是提高空間有限的存儲元件中數據存儲能力。在鈔票、身份證、商標標簽等的防偽印刷中，復合有助于防止偽造、篡改或仿造，為了該目的，已經使用熱變色、磁性、多色熒光劑和光變可變色油墨。復合一般需要地理想由納米/微米尺寸物體承載的光學編碼的矩陣，每種物體應當可高速準確確定，并優選低成本的。
[0004]原則上，用于復合分析技術的平面陣列生物芯片提供基于平面陣列中微點預定位置的無限復合能力。然而，實際上，此技術未提供足夠準確的量化數據。例如，因為其要求高度精確的機器人編碼、擴散問題和/或每個反應微點之間變化的生物環境。另外，相對較高的制造成本和要求在分析前制造確定格式的陣列板妨礙或抑制有益定制。
[0005]懸液陣列是新興技術，將是未來基于復合分析的分子檢測的領導技術。懸液陣列基于特別編碼(最常用的是改變熒光染料組合)的全部微球。因此，微球被賦予一系列分別分配給特定分析物的個體可確定顏色編碼。懸液陣列的主要優勢包括快速反應動力學、無需洗滌帶來更高的樣品通量及微球系列的再現制造。由于微載體的均勻表面、使用簡單及與替代產品相比費用降低，懸液陣列還為量化分析提供了可能性。
[0006]目前使用懸液陣列可得到的光譜復合水平限制為約100，通過在不同強度比下用熒光染料編碼微球實現。通過使用顏色和強度產生更大量的編碼比較困難，因為在最受歡迎的微球材料聚苯乙烯中熒光染料和本底熒光的寬光譜寬度。替代方法包括使用不同尺寸和形狀的微球、圖案化反射金屬納米棒、微加工特征、空間選擇光學漂白微球、稀土質譜流式細胞術和稀土摻雜玻璃微條形碼。這些方法被認為不可能成為主流，因為存在各種缺陷(例如尺寸大和/或高密度材料)。
[0007]圖形編碼，例如將顆粒設計為ID條形碼、2D甚至是3D型式，提供可與平面陣列媲美的復合能力。但是，圖形代碼的解密需要主動定向機制和高分辨率的型式確定，基本限制分析通量。電子編碼還可以形成大量代碼，但是主要缺點來自對大尺寸的要求(>100 μπι)。包括利用拉曼散射、IR吸收或質譜指紋的圖譜編碼以及利用尺寸、形狀和磁的物理編碼的其他技術的應用也因其各自的局限而受到限制。
[0008]基于不同熒光色帶的數字化強度的光學編碼被視為是最可行的方法。然而，盡管嘗試使用新型材料如量子點取代傳統有機染料，但是當需要多于約十種強度時，熒光探針的光譜重疊是有問題的。光學編碼的復合能力實際上仍局限為約102。給如此龐大數量的編碼解碼呈現出另一個難題。盡管在原則上基于成像的解碼系統能夠給任何懸液陣列解碼，但是平面上一些顆粒高度的細微變化都將嚴重妨礙基于強度的解碼過程。
[0009]因此，還有些懸而未決的問題需要克服或改進，以提供新或改善的復合分析和/或陣列，例如能夠增加編碼維數，其中表面量化結合分析對這些編碼免疫。這些編碼應該能夠在高通量條件下被解開。
[0010]本說明書中提及的任何現有出版物(或來自現有出版物的信息)或任何已知事物均不得視為或應該被視為承認、許可或任何形式的表明現有出版物(或從現有出版物得到的信息)或已知事物構成本發明相關領域公識常識的一部分。
【發明內容】
[0011]提供該總結是為了簡單介紹在下面優選實施方式中詳細說明的概念選擇。該總結并不旨在確定權利要求主題事物的關鍵特征或重要特征，也不是為了限制權利要求主題事物的范圍。
[0012]在各種形式中，本發明提供一種系統、設備和/或用于復合分析的方法。具體但不限于實例，提供了一種復合陣列如懸液陣列。
[0013]作為具有一般臨床潛能的平面陣列的替代品，懸液陣列遭受內部容量實際限制為約12個編碼的問題。申請人已經開發了一種新型復合陣列，在一個優選實例中，提供了一種利用和/或設計探針的熒光衰減壽命編碼懸液陣列以及解碼由時間分辨光譜產生、得到或形成的編碼的方法。在一個實例形式中，可以在不同色帶形成壽命種群，例如通過用于不同探針的多重機制。
[0014]采用一種新型基于時域的技術或維度，或用之取代或與傳統光譜和強度組合結合，從而擴展復合陣列如懸液陣列的復合能力。在一個實例形式中，傳統懸液陣列的復合能力可以擴展至約16數量級。通常，傳統光譜編碼能夠形成用于珠面生物分析的自發熒光背景，影響靈敏度和量化性能。
[0015]申請人已經意識到利用壽命(與熒光直接相關的參數)的潛能，使得除了光譜和強度，可以利用壽命形成光學標識(optical identity)的新維度，用于針對高通量篩選的復合檢測。特別地，與已知傳統方法相比，熒光探針為壽命維度提供了更大的用武之地和無背景優勢，使得壽命的控制和差分提供實際和準確的替代方法。
[0016]在實例形式中，申請人已經開發了基于稀土熒光的光學編碼和/或探針，其在可見光照明下為黑暗，以及用于敏化和量化表面分子生物分析的無背景或背景減少的基質如珠基質。這個及其他實例形式為復合分析提供了一種可靠、高通量且相對便宜的方案，帶來大量機遇或應用，例如生命科學和生物應用包括基因組學、蛋白質組學、藥物學、診斷學等，防偽應用包括防偽油墨、或鈔票、身份證、商標標簽等的防偽印刷，以及數據存儲應用。
[0017]一方面，本發明提供了一種用于確定復合陣列中熒光探針的復合分析方法，該方法包括:激發所述熒光探針以產生熒光；以及測量由激發所產生的熒光的衰減壽命。
[0018]另一方面，提供了一種用于檢測分析物的復合分析系統，所述系統包括:配置為結合分析物的熒光探針；用于激發熒光探針以產生熒光的激發器；以及用于測量由激發所產生的熒光的衰減壽命的檢測器。
[0019]另一方面，本發明提供了一種用于復合陣列的熒光探針，所述熒光探針包括能夠被激發以產生熒光的稀土元素，從而能夠測量激發所產生的熒光的衰減壽命。
[0020]優選地，復合陣列為懸液陣列。
[0021]在一個實例中，該方法還包括:激發多個熒光探針以產生熒光；測量熒光的多個衰減壽命；以及時間分辨熒光，以確定熒光探針的類型。
[0022]在另一個實例形式中，時間分辨熒光提供不同類型的熒光探針的壽命種群(lifetime populat1n)。在另一個實例形式中，衰減壽命為微秒衰減壽命。在另一個實例形式中，時間分辨熒光提供一個或多個編碼。在另一個實例形式中，在不同色帶形成時間分辨熒光。在另一個實例形式中，不同色帶用于提供基于時域的光學標識的文庫。在另一個實例形式中，激發探針包括將探針暴露于電磁輻射中。
[0023]在另一個實例形式中，通過UV輻射激發熒光探針。在另一個實例形式中，通過IR輻射激發熒光探針。在另一個實例形式中，熒光探針在可見光激發時保持黑暗。在另一個實例形式中，熒光探針為微球的一部分。在另一個實例形式中，探針包括一種或多種稀土元素。在另一個實例形式中，所探針包括一種或多種鑭系元素。
[0024]在另一個實例形式中，已經使用熒光共振能量轉移(LRET)改變了熒光探針的衰減壽命。在另一個實例形式中，使用LRET先前調整具有可區分衰減壽命的兩種或更多種探針。
[0025]在另一個實例形式中，熒光探針包括一種或多種納米晶體。在另一個實例形式中，熒光探針的衰減壽命通過改變納米晶體已經改變。在另一個實例形式中，通過調整納米晶體的摻雜濃度已經改變了熒光探針的衰減壽命。在另一個實例形式中，納米晶體為稀土摻雜的上變頻(上轉換，upconvers1n)納米晶體。在另一個實例形式中，通過改變供體與受體距離，改變衰減壽命。在另一個實例形式中，通過改變供體和受體的各自濃度，改變供體與受體距離。在另一個實例形式中，通過調整敏化劑(sensitizer)-激活劑的濃度差，改變熒光探針的衰減壽命。在另一個實例形式中，納米晶體摻雜鐿敏化劑和鉺或銩發射劑。在另一個實例形式中，納米晶體被封裝到微球中。在另一個實例形式中，通過調整納米晶體的尺寸，已經改變熒光探針的衰減壽命。在另一個實例形式中，通過調整納米晶體的晶體相，改變熒光探針的衰減壽命。在另一個實例形式中，在單個色帶中，存在多于十個具有不同衰減壽命的納米晶體種群。
[0026]在另一個實例形式中，衰減壽命在25.6ys至662.4ys之間。在另一個實例形式中，通過添加淬滅染料已經改變熒光探針的衰減壽命。在另一個實例形式中，通過在探針內使用金屬基體(matrix)調整衰減壽命已經改變熒光探針的衰減壽命。在另一個實例形式中，焚光探針包括不同鑭系元素復合螯合物(complex chelate)或不同基質晶體(hostcrystal)結構。在另一個實例形式中，除了測量熒光光譜和熒光強度，還測量熒光衰減壽命O
[0027]在其他實例形式中，探針選自微球、組裝以提供微球的納米顆粒或納米晶體、稀土摻雜的二氧化硅微球、嵌入鈀(Pd)和/或鉑(Pt)磷光的微球、嵌入電荷轉移(CT)激發躍迀發射劑的微球及嵌入釕、鋨或錸電荷轉移(CT)激發躍迀發射劑的微球的組中。
[0028]在另一個實例形式中，提供了至少五個紅色帶中的不同衰減壽命。在另一個實例形式中，提供了至少五個藍色帶中的不同衰減壽命。在另一個實例形式中，提供了至少四個綠色帶中不同衰減壽命。在另一個實例形式中，對于UV脈沖激發束(excitat1n beam)和IR脈沖激發束照射，使用帶通濾色器將探針分辨為四個通道(channel)，每個通道具有初始強度參數和衰減壽命參數，從而提供八個維度。
[0029]在其他實例形式中，探針為納米或微米標簽、球、顆粒或載體。在其他實例形式中，探針包括選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥、鈧和釔中的元素。
【附圖說明】
[0030]從以下說明中，實例實施方式應該變得顯而易見，其僅是通過至少一個優選而非限制性實施方式的實施例并結合附圖描述給出。
[0031]圖1示出了一種時間分辨懸液陣列的實例解碼概念。
[0032]圖2通過每個微球的壽命直方圖示出了編碼微秒域時間分辨懸液陣列的實例方法。具體地，(a)熒光共振能量轉移法，(b)將上變頻納米晶體作為構造單元的實例懸液陣列組件，(C)通過調節敏化劑-激活劑的濃度差的上變頻能量轉移方法，及(d)通過調整上變頻納米晶體的尺寸和相位的尺寸相關的熒光方法。
[0033]圖3示出了單個微球的實例繪圖，以及攜帶編碼壽命的五個種群的時間分辨分離。
[0034]圖4示出三維時間分辨光譜，例如應用UV和IR脈沖激發束后的編碼微球(a)，其可以使用帶通彩色過濾器分解成四個通道，每個通道有自己的初始強度和衰減壽命作為兩個獨立參數(b)，導致共計八個維度作為八個數字(C)。
[0035]圖5a示出了 Eu螯合物(低于365nm)、Er和Tm上變頻納米晶體(低于980nm)的標準化發射光譜。
[0036]圖5b示出了 Er和Tm發射帶在不同強度水平時的光譜重疊。
[0037]圖5c示出了對實例微球測得的壽命，與并入相同單個探針的微球相比，這種微球并入了混合探針(Eu、Er和Tm)。
[0038]圖6示出了 LRET設計的每個含Eu微球的實例壽命測量結果。將含有相同數量Eu復合物的不同溶液作為供體，之后將數量不斷增加的受體染料