血管緊張素Ⅰ檢測試劑盒及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種用于檢測血管緊張素 I的化學發光免 疫檢測試劑盒。本發明還涉及該試劑盒的制備方法，以及使用該試劑盒來檢測血管緊張素 I濃度的方法。
【背景技術】
[0002] 血管緊張素 I (Angiotensin I，A I )是由腎素作用于肝臟分泌的血管緊張素原 而產生，A I產生的速率是表示腎素活性（PRA)的重要指標之一。
[0003] 腎素-血管緊張素-酸固酬系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)是一個激素系統，當大量失血或血壓下降時，腎臟分泌腎素，腎素催化血管緊 張素原水解產生A I，A I基本沒有生物學活性，而是經血管緊張素轉化酶（Angiotensin Converting Emzyme，ACE)剪切C-末端兩個氨基酸殘基而形成A II。A II具有高效的收縮 血管作用，從而使血壓升高。A II也能刺激腎上腺皮質分泌醛固酮，醛固酮能促進腎臟對水 和鈉離子的重吸收，繼而增加體液容量，升高血壓。
[0004] 目前，臨床上測定A I的方法主要有放射性免疫法、酶聯免疫法等。例如，北京 北方生物技術研宄所生產的碘[125I]A I放射免疫分析藥盒采用競爭法原理測定血漿中的 A I含量。加入樣本和兔抗-A I抗體（藍色）及125I-A I標記物（紅色）后，125I-A I標記 物與樣本中的A I競爭結合兔抗-A I抗體，加入驢抗兔免疫分離劑，充分搖勻后，室溫放置 15min，3000轉/分離心15min，去上清，測沉淀管的放射性計數（cpm)。樣本中的A I濃度 依據由校準品濃度和對應的放射性計數建立的Log-Logit數學模型進行定量，從而檢測樣 本中的A I含量。
[0005] 然而，放射性免疫法及酶聯免疫法存在諸多不足。例如，上述放射性免疫法存在放 射性污染、標記物半衰期短、對操作者具有放射性損傷，且操作繁瑣，耗時長，靈敏度低，檢 測范圍窄，且不能實現全自動化的缺陷。傳統的放射性免疫法或酶聯免疫法方法檢測時間 長，同時主要依靠純手工加樣等系列繁瑣操作，效率低，容易導致實驗結果誤差大；由于酶 促反應不夠徹底，且易受外部干擾因素影響，如溫度、時間及材料濃度影響，因此檢測時特 異性低，靈敏度差，檢測范圍窄。因此，本領域亟需一種在靈敏度高的同時提高檢測試劑的 安全性和穩定性，操作更加簡便，還能夠借助分析儀器實現檢測過程全自動化的檢測A I 的檢測試劑盒。
【發明內容】
[0006] 為了解決上述現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種用于檢測A I的 化學發光免疫檢測試劑盒，以獲得高的檢測靈敏度和準確性，還能提高檢測試劑的穩定性， 延長檢測試劑的保存時間。
[0007] 本發明還提供用于檢測A I的化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法。
[0008] 另外，本發明還提供根據本發明提供的A I化學發光免疫檢測試劑盒的應用，尤 其是采用該試劑盒，通過全自動化學發光法進行A I檢測的方法，減少操作時間，降低人為 操作誤差，同時利用化學示蹤標記物的特異性，提高檢測靈敏度。
[0009] 根據本發明，提供了一種用于檢測A I的化學發光免疫檢測試劑盒，所述試劑盒 包括組分A和組分B，所述組分A為A I抗原或A I抗原與蛋白載體的連接物，組分B為抗 A I抗體，所述組分A和組分B中的一種標記示蹤標記物，另一種包被磁球。
[0010] 應理解，在本發明提供的上述試劑盒中，所述抗A I抗體可以是一種或多種抗A I 單克隆抗體和/或抗A I多克隆抗體。實際上，在本發明中所提及的抗體都可以是單克隆 抗體和/或多克隆抗體。
[0011] 本發明適用的蛋白載體可以選自本領域常用的蛋白載體中的至少一種。例如，所 述蛋白載體選自牛血清白蛋白（BSA)、人血清白蛋白（HSA)、兔血清白蛋白（RSA)、血藍蛋白 (KLH)、牛IgG、人IgG、卵清蛋白（OVA)、肌紅蛋白和甲狀腺球蛋白中的至少一種。
[0012] 根據本發明，所述示蹤標記物可以選自本領域中常用于標記抗原或抗體的示蹤標 記物，例如選自金剛烷、魯米諾及其衍生物、異魯米諾及其衍生物、吖啶酯、堿性磷酸酶和辣 根過氧化物酶中的至少一種，優選為N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)。
[0013] 根據本發明，所述示蹤標記物直接標記或者間接標記A I抗原（或其與蛋白載體 的連接物）或抗A I抗體。其中，間接標記包括但不限于通過異硫氰酸熒光素（FITC)與抗 FITC抗體體系或鏈霉親和素（SA)與生物素（Biotin)體系間接標記。所述"直接標記"是 指ABEI直接與待測抗原或針對待測抗原的抗體連接進行標記；所述"間接標記"是指通過 中間媒介鏈接體系使得ABEI標記A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）或抗A I抗體，所 述中間媒介鏈接體系包括但不限于FITC與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系。 本發明人發現，間接標記有利于減弱空間效應，有利于信號的放大，使得檢測更加靈敏。
[0014] 根據本發明，A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）或抗A I抗體直接包被磁球， 或者通過FITC與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系間接包被磁球。所述"直接 包被"是指利用A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）或抗A I抗體直接對磁球進行包被； 所述"間接包被"是指通過中間媒介鏈接體系，使得A I抗原（或其與蛋白載體的連接物） 或抗A I抗體對磁球進行包被，所述中間媒介鏈接體系包括但不限于FITC與抗FITC抗體 體系或鏈霉親和素與生物素體系。同樣，間接包被的優點在于，有利于減弱空間效應，有利 于信號的放大，使得檢測更加靈敏。
[0015] 適用于本發明的磁球也稱為磁珠，可以是本領域中常用的磁性微球。優選的是，本 發明使用的磁球，是將納米級的Fe 2O3或Fe3O4磁性粒子和有機高分子材料進行復合，形成具 有超順磁性和極大量蛋白吸附容量的微米級的固相微球，具有在外加磁場作用下可迅速被 磁化，在撤走磁場后剩磁為零的屬性。其中，所述有機高分子材料的種類沒有特別限制，可 根據需要進行選擇。
[0016] 本發明所使用的磁性微球應能滿足直徑為0. 1-5 μ m，磁性微球還可以通過表面改 性而帶有多種活性功能基團，包括但不限于-OH、-C00H、-NH2。
[0017] 在一個具體實施例中，所述磁球為Fe2O3或Fe 304磁性納米粒子與有機高分子材料 的復合體，并具有〇. 1-5 μ m的粒徑；并且，所述磁球任選地通過表面改性而帶有一種或多 種活性功能基團。
[0018] 根據本發明的一些實施方案，所述試劑盒包括選自組分Al和組分A2中的任意一 種的組分，以及選自組分B1、組分B2和組分B3中的任意一種的組分；其中，組分Al為ABEI 直接標記的A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）；組分A2為鏈霉親和素標記的ABEI和生 物素化的A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）；組分Bl為抗A I抗體直接包被的磁球； 組分B2為生物素化的抗A I抗體和鏈霉親和素包被的磁球；以及組分B3為抗A I抗體標 記的FITC和抗FITC抗體包被的磁球。
[0019] 根據本發明的另一些實施方案，所述試劑盒包括選自組分Cl和組分C2中的任意 一種的組分，以及選自組分Dl、組分D2和組分D3中的任意一種的組分；其中，組分Cl為 ABEI直接標記的抗A I抗體；組分C2為鏈霉親和素標記的ABEI和生物素化的抗A I抗體； 組分Dl為A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）直接包被的磁球；組分D2為生物素化的 A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）和鏈霉親和素包被的磁球；以及組分D3為A I抗原 (或其與蛋白載體的連接物）標記的FITC和抗FITC抗體包被的磁球。
[0020] 根據本發明，所述試劑盒還可以包括A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）的低 點校準品和高點校準品，并任選地包括緩沖液。本發明所述低點校準品與高點校準品是兩 者相對而言，其中"低點校準品"，是指將A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）用50%牛 血清制品稀釋成濃度為〇.2-2ng/ml得到的校準品；而"高點校準品"是指將A I抗原（或 其與蛋白載體的連接物）用50%牛血清制品稀釋成濃度為8-24ng/ml得到的校準品。
[0021] 根據本發明提供的試劑盒，所包含的各成分濃度優選如下：AI抗原為 0· 002-0. 01mg/ml ;抗AI 抗體為 0· 05-lmg/ml ;磁球為 0· 05-lmg/ml ;FITC為 0· 002-0.0 lmg/ ml ;抗 FITC 抗體為 0· 05-lmg/ml ;鏈霉親和素為 0· 05-lmg/ml ;生物素為 0· 002-0. 01mg/ml ; 示蹤標記物為0.2-lmg/l ;以及如果使用了蛋白載體，其濃度為2-10mg/l。上述各成分的濃 度均基于包含該成分的單獨的試劑盒組分的量計。
[0022] 在本發明的一種實施方案中，在本發明的試劑盒中，在A I抗原（或其與蛋白載體 的連接物）上標記ABEI，并用抗A I抗體包被磁球。
[0023] 例如，在本發明的一個具體的實施例中，所述試劑盒包括標記A I抗原（或其與蛋 白載體的連接物）的ABEI、抗A I抗體包被的磁球、低點校準品和高點校準品。
[0024] 例如，在本發明的一個具體的實施例中，所述試劑盒包括標記A I抗原（或其與蛋 白載體的連接物）的ABEI、生物素化的抗A I抗體、鏈霉親和素包被的磁球、低點校準品和 尚點校準品。
[0025] 例如，在本發明的一個具體的實施例中，所述試劑盒包括標記A I抗原（或其與蛋 白載體的連接物）的ABEI、抗A I抗體標記的FITC、抗FITC多克隆抗體包被的磁球、低點 校準品和尚點校準品。
[0026] 例如，在本發明的一個具體的實施例中，所述試劑盒包括生物素化的A I抗原（或 其與蛋白載體的連接物）、鏈霉親和素標記的ABEI、抗A I抗體包被的磁球、低點校準品和 尚點校準品。
[0027] 在本發明的另一種實施方案中，在本發明的試劑盒中，在抗A I抗體上標記ABEI， 并用A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）包被磁球。
[0028] 例如，在本發明的一個具體的實施例中，所述試劑盒包括標記抗A I抗體的ABEI、 A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）包被的磁球、低點校準品和高點校準品。
[0029] 例如，在本發明的一個具體的實施例中，所述試劑盒包括標記抗A I抗體的ABEI、 標記A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）的FITC、抗FITC多克隆抗體包被的磁球、低點 校準品和尚點校準品。
[0030] 例如，在本發明的一個具