一種基于聚乙二醇修飾的傳感器及其檢測凝血酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于聚乙二醇修飾的傳感器及其檢測凝血酶(thrombin)的方法，具體涉及一種基于聚乙二醇(PEG)修飾的石墨烯氧化物(GO) —核酸適配體(aptamer)傳感器及其檢測凝血酶的方法，屬于生物醫學領域中的蛋白質檢測方法。
【背景技術】
[0002]人的凝血酶是凝血連鎖反應的主要效應蛋白酶。除了能夠切割纖維蛋白原外，還發現能夠特異性切割人類免疫缺陷病毒-1型(HIV-1) V3環保守的冠部并促進HIV-1介導的細胞融合；此外，thrombin及細胞表面thrombin受體表達的上調可能與HIV-1相關腦病的發生相關，thrombin在凝血系統的許多疾病中發揮著關鍵性作用。過量表達thrombin能夠導致血栓形成，但是它若表達不足則可能導致血友病。因此，準確地監控thrombin對于確定給定病人的合適治療方法是至關重要的(Liu S., Zhang X.Y., Luo ff.X.，WangZ.X.，Guo X.F.，Steigerwald M.L，Fang X.H.，Single-Molecule Detect1nof Proteins Using Aptamer-Funct1nalized Molecular Electronic Devices,Angewandate Chemie Internat1nal Edit1n, 2011， 50: 2496-2502.)。
[0003]GO制備簡單，成本比較低，從而在生物檢測中得到廣泛的應用，而且GO在與DNA相互作用時，有一個重要的特點，單鏈DNA通過Ji 一 Ji效應，能吸附到GO表面(Qian，Z.S.，Shan, X.Y.，Chaij L J.，Maj J.J.，Chen, J.R.，Fengj H.，Nanoscalej2014，6: 5671 - 5674.；He, Y.，Jiao, B.N.，Tangj Η.1，RSC Advances, 2014，35，8294 - 18300.)，aptamer 是一種單鏈 DNA，能特異性地結合 thrombin，當 thrombin 與aptamer特異結合后，aptamer會脫離GO表面,一些研究者基于這個特點,通過突光標記的aptamer 對 thrombin 進行特異性檢測(Wang, L., Zhu, J.B., Han, L., Jin, L.H.,Zhu, C.Z., Wang, E.K., Dong, S.J., ACS Nano, 2012, 6, 6659 - 6666.；Bai, Y.F., Feng, F., Zhao, L., Wang, C.Y., Wang, H.Y., Ti an, M.Z., Qin, J., Duan,Y., L., He, X.X.，B1sensors and B1electronics, 2013, 47, 265 - 270.),但這個方法存在一個缺點:被檢測的thrombin能非特異性地吸附到GO表面，從而阻止檢測靈敏性的提高。為發展高靈敏、快速地、低成本地檢測thrombin的方法，我們利用PEG阻止GO表面非特異性吸附的thrombin,提高檢測的靈敏度,發展一種靈敏度較高的thrombin的檢測方法。
【發明內容】
本發明目的是提供一種基于PEG修飾的GO傳感器及其對thrombin的檢測方法，PEG能阻止GO表面對thrombin的非特異性吸附,從而高靈敏、快速、低成本對thrombin進行檢測。
[0004]—種基于PEG修飾的傳感器，按照以下方法制備:
(1)制備GO:通過改良的Hummers法大批量制備G0，將GO真空干燥備用，使用前，在水溶液中超聲分散；
(2)PEG的修飾:加入PEG，PEG通過自組裝與GO表面相結合，阻止thrombin非特異吸附，加入的PEG的濃度為50 nM ；
(3)合成 thrombin 的 aptamer:5’ - GG TTG GTG TGG TTG G -3’，5’ 末端標記羧基熒光素(FAM)；
(4 )熒光淬滅:將aptamer加入到GO水溶液中，即制備成為基于PEG修飾的檢測aptamer的GO-aptamer傳感器；G0能夠淬滅aptamer末端標記的FAM的突光；其中aptamer的濃度為5-40 nM ；G0的濃度為6 -50 Pg/mL ；
(5)thrombin的檢測:加入thrombin, aptamer結合thrombin后，FAM的突光得到恢復，根據熒光強度的變化，從而對其進行檢測。
[0005]基于PEG修飾的GO-aptamer傳感器對thrombin檢測方法為:
(I)制備GO:通過改良的Hummers法大批量制備G0，將GO真空干燥備用，使用前，在水溶液中超聲分散。
[0006](2)PEG的修飾:加入PEG，PEG通過自組裝與GO表面相結合，阻止aptamer非特異吸附，加入的PEG的濃度為50 nM ；
(3)合成thrombin 的 aptamer:5’ - GG TTG GTG TGG TTG G -3’，5’ 末端標記 FAM ；
(4)熒光淬滅:將aptamer加入到含有PEG的GO水溶液中，即制備成為基于PEG修飾的檢測thrombin的GO-aptamer傳感器；G0能夠淬滅aptamer末端標記的FAM的突光；其中 thrombin 的濃度為 5_40 nM ；G0 的濃度為 6 -50 M-g/mL ；
(5)thrombin的檢測:加入thrombin, aptamer結合thrombin后，FAM的突光得到恢復，根據熒光強度的變化，從而對其進行檢測。
[0007]本發明具有以下優點:
1.本發明中GO易于獲得，方法簡單、成本低，充分利用GO能淬滅單鏈DNA末端標記的熒光，當蛋白質結合單鏈DNA后，熒光恢復的特點，能快速、特異性、高靈敏性對th1mbin進行檢測。
[0008]2.本發明采用PEG阻止GO對thrombin的非特異性吸附，解決基于GO傳感器檢測thrombin中的非特異吸附的問題，從而增加檢測的特異性，進一步提高檢測的靈敏性。
【附圖說明】
[0009]圖1:本發明的流程示意圖；
圖2:基于GO傳感器對thrombin靈敏性檢測圖；
圖3:基于GO傳感器對thrombin選擇性檢測圖；
圖4:PEG修飾GO傳感器對thrombin檢測的影響圖；
圖5:PEG修飾GO傳感器對0.03 nM thrombin檢測圖，圖中曲線由上至下依次為aptamer、aptamer-GO-PEG-0.03nM thrombin、aptamer-G0-PEG 檢測結果曲線。
[0010]圖6:PEG修飾GO傳感器對0.01 nM thrombin檢測圖，圖中曲線由上至下依次為aptamer、aptamer-GO-PEG-0.0lnM thrombin、aptamer-G0-PEG 檢測結果曲線。
【具體實施方式】
[0011]以下結合實施例對本發明做進一步說明，實施例是用于說明本發明而不是用于限制本發明的范圍。
[0012]實施例1:
(I)制備GO:通過改良的Hummers法大批量制備G0，在三口燒瓶中，加入3g鱗片石墨粉、1.5 g似勵3與69 mL濃硫酸后放入恒溫水浴鍋中攪拌。反應Ih后加入Ig KMnO4, 350C下反應5個小時后加入150 mL去離子水。在溫度98°C下反應30 min后，再加入50 mL的去離子水、5 mL H2O2以及250 mL的10%稀鹽酸，將溶液倒入1000 mL的大燒杯中，洗滌至PH值為5-6。將氧化產物