狂犬病毒均質熒光復合微球的制備方法及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及狂犬病毒均質熒光復合微球的制備方法及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 狂犬病毒（Rabies virus，RV)的糖蛋白（簡稱RVG)是唯一能刺激機體產生中和抗 體的病毒蛋白，同時也是很好的檢測抗原。因此，將狂犬病毒糖蛋白在大腸桿菌中進行高效 表達，經Western blot等方法驗證純化后的重組蛋白可與RV陽性血清產生特異性反應，這 為RV抗體檢測試劑盒的研制奠定了基礎。
[0003] 時間分辨突光分析法（Time-resolved Fluoroimmunoassy，TrFIA)利用綱系兀素 螯合物標記抗原、抗體、多肽、激素等，發生如抗原/抗體免疫反應、生物素/親和素反應等 反應后，加入增強液解離鑭系元素，使其熒光信號得到加強，再經外源性脈沖光激發，并采 用延時讀取等光電技術檢測鑭系元素的特異熒光，從而達到對樣品分析檢測的目的。由 于發光物質銪離子和螯合劑結合后與包被的抗原或抗體進行免疫反應，形成的抗原-抗 體-銪標記物復合物在弱堿性緩沖液中經激發光激發所發生的熒光信號甚弱，須加入增強 液（β-酮體、T0P0、Triton X-100、pH2-3的醋酸和鄰苯酸氫鉀的酸性溶液)，使稀土離子從 絡合物上離下來，與新的絡合物結合形成大分子的微囊，這種微囊將能量傳遞給Eu 3+，阻斷 水所產生的淬滅效應，使原來的熒光信號增強近100萬倍，利于熒光測量。可見，增強液在 TrIFA中是不可或缺的。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供狂犬病毒均質熒光復合微球的制備方法及其檢測方法。
[0005] 本發明所采取的技術方案是： 狂犬病毒均質熒光復合微球的制備方法，包括以下步驟： 1) 制備聚苯乙烯納米微球； 2) Eu3+的標記：將聚苯乙烯納米微球懸浮于無水乙醇，加入絡合劑BHHCT，避光反應 15~25min，用無水乙醇洗滌，Tris-HCl緩沖液重懸后，加入EuCl 3，避光反應16~25min ; 離心，再用無水乙醇重懸沉淀，加入氨基硅烷，避光反應1. 5~2. 5小時，洗滌，得均質熒光 復合微球； 3) 抗原的標記： a、 取均質突光復合微球，重懸于無水乙醇，加入碳化二亞胺，避光反應23~35min ; b、 離心，磷酸鹽緩沖液重懸，加入狂犬病毒抗原，避光反應12~20h ; c、 加入20%BSA溶液，反應22~35min ; d、 離心，洗滌，得到用于檢測狂犬病毒的標記狂犬病毒抗原的均質熒光復合微球。
[0006] 優選的，步驟1)中，將聚乙烯吡咯烷酮、過硫酸鉀、苯乙烯以質量比25:0. 6:100溶 于乙醇水溶液，氮氣保護下進行聚合反應；離心，用無水乙醇重懸沉淀，加入氨基硅烷，避光 反應1. 6~3小時，洗漆，制得聚苯乙烯納米微球。
[0007] 優選的，超聲條件下，52~65 °C，進行聚合反應。
[0008] 優選的，步驟2)中，BHHCT與聚苯乙烯納米微球的質量比為1:50。
[0009] 優選的，步驟3)中，均質熒光復合微球與碳化二亞胺的質量比為1:1。
[0010] 狂犬病毒的檢測方法，包括以下步驟： 1) 用pH7. 4、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液將重組金黃色葡萄球菌蛋白A稀釋后，加入到 酶標板孔內，每孔100 μ L，2~8°C放置13~18小時； 2) 每孔加入200 μ L封閉液，2~8°C放置13~18小時； 3) 棄去板內液體，洗板，晾干； 4) 將標準品或待檢樣品加入到酶標板孔內，每孔100 μ L，37°C孵育； 5) 棄去板內液體，洗板，晾干； 6) 將權利要求1~5任意一項所述方法制備的狂犬病毒均質突光復合微球稀釋后，加 入到酶標板孔內，每孔100μ L，37°C孵育； 7) 棄去板內液體，洗板，晾干； 8) 以多功能酶標儀的時間分辨突光模式檢測突光信號，激發光波長為330nm，發射光 波長為6IOnm ; 9) 以標準品濃度的對數值為橫坐標，測得相對熒光單位的對數值為縱坐標，獲得標準 曲線，對比待檢樣品的檢測值，判定結果。
[0011] 優選的，步驟1)中，重組金黃色葡萄球菌蛋白A的稀釋濃度為2μ g/mL。
[0012] 優選的，步驟6)中，狂犬病毒均質熒光復合微球的稀釋倍數為5000倍。
[0013] 優選的，步驟4)孵育60min，步驟6)孵育。
[0014] 優選的，封閉液含pH7. 4、0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，4%BSA，0. 01%的NaN3。
[0015] 本發明的有益效果是： 本發明在傳統TrFIA基礎上，用納米微球作為熒光物質Eu3+的載體，即在功能化內核的 聚合作用下形成均質熒光復合微球，然后通過螯合作用交聯RVG。本發明使用的雙功能絡 合劑BHHCT由于只有一個氯磺酞基，一端與稀土元素連接，一端與抗原或抗體連接，避免了 蛋白質分子之間的交聯反應，且由于熒光物質Eu 3+沒有和生物大分子直接接觸，不會影響 生物活性，不需要進行解離和增強。并且，均質熒光復合微球表面覆有氨基硅烷形成的保護 層，熒光信號受外界環境影響降低，狂犬病毒均質熒光復合微球的穩定常數高達1〇 1(1，熒光 壽命達到幾百微秒，可很好的滿足時間分辨熒光免疫分析的需要。
[0016] 本發明狂犬病毒均質熒光復合微球的制備方法簡單，檢測成本低，減少了操作步 驟和反應時間，更容易實現自動化操作；儀器讀數更高，線性范圍更寬，檢測靈敏度明顯高 于 ELISA。
【附圖說明】
[0017] 圖1為聚苯乙烯納米微球的掃描電鏡照片。
[0018] 圖2為均質熒光復合微球的Eu3+熒光光譜。
[0019] 圖3為實施例2均質熒光復合微球檢測方法建立的標準曲線。
【具體實施方式】
[0020] 提高TrFIA靈敏度的關鍵是稀土元素絡合劑。本發明使用的雙功能絡合劑4， 4' -二（1 "，1"，1"，2"，2"，3"，3" -七氟-4"，6" -己二酮-6" -基）-氯磺酰基-鄰二苯基 苯（BHHCT)是Yuan等（Yuan，J，etal.，1998)研發的一種穩定的能發出強烈熒光的Eu 3+ 絡合劑，它所含有的四配位基團比以往的β_二酮類絡合劑在靈敏度上有了很大的提高。 BHHCT由于只有一個氯磺酞基，一端與稀土元素連接，一端與抗原或抗體連接，避免了蛋白 質分子之間的交聯反應。
[0021] 以下實施例中所用金黃色葡萄球菌細胞壁的重組蛋白A (重組蛋白SPA)購自北京 義翹神州生物技術有限公司；熒光螯合物BHHCT、重組狂犬病毒抗原RVG由北京泰普生物技 術公司饋贈；抗犬溫熱病毒抗體、抗犬細小病毒抗體購自Hytest ;ELISA試劑盒購自北京北 瑞達醫藥科技有限公司；標準品質控血清由本實驗室保存。
[0022] 實施例1 狂犬病毒均質突光復合微球的制備： (1)功能化內核聚苯乙烯納米微球的制備 將2.58聚乙烯吡咯烷酮（？￥?)、0.068過硫酸鉀（即5)、1(^苯乙烯（5〇加入到2501111 無水乙醇/水介質中溶解后置于超聲波反應器中，通氮氣，開啟超聲波發生器，60°C下進行 聚合反應，得到聚苯乙烯納米微球分散液。離心收集沉淀，以無水乙醇懸浮，加入氨基硅烷， 室溫攪拌反應，無水乙醇洗滌后收集聚苯乙烯納米微球，無水乙醇懸浮保存備用。
[0023] (2 ) Eu3+標記納米微球 將納米微球懸浮液濃縮至20mg/mL，向5mL懸浮液加入0. 5mL的4mg/mL BHHCT的乙 醇溶液，室溫避光攪拌反應20min ;以無水乙醇洗滌，Tris-HCl緩沖液重懸，加入0. 5mL的 0. 01mol/L EuCl3溶液，室溫避光攪拌反應20min ;離心收集后再以無水乙醇懸浮，