一種喘可治注射液4種黃酮類有效成分檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥領域，尤其是涉及一種喘可治注射液有效成分的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 喘可治注射液是國家二類中藥新藥，系由淫羊藿和巴戟天藥材組成，具有溫和補 腎，平喘止咳，有抗過敏、增強體液免疫與細胞免疫的功能，且毒副反應小，藥用機理明確， 在免疫功能紊亂性疾病如哮喘、慢性支氣管炎的臨床應用前景廣闊。
[0003] 喘可治注射液中含有主要成分為黃酮苷，黃酮苷分別為朝藿定A、朝藿定B、朝藿 定C及淫羊藿苷的含量，這些黃酮苷來自淫羊藿藥材。淫羊藿藥材來源多，成分復雜質量不 好控制。目前喘可治注射液所用的箭葉淫羊藿藥材未見對朝藿定A、朝藿定B的定量分析， 現行的喘可治注射液含量測定方法只需考察朝藿定C與淫羊藿苷的量，還沒有對其它黃酮 類成分的含量分析。
[0004] 液相質譜聯用技術因分析快速、樣品處理簡潔、靈敏度高而越來越頻繁地用于中 藥質量分析中。因此本研究采用高效液相色譜-串聯質譜法快速、準確測定喘可治注射液 中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷這4種黃酮苷的含量，為喘可治注射液提供更加 完備可靠的質量控制手段。
【發明內容】
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明提供了一種喘可治注射液4種黃酮類有效成分檢 測方法，該方法穩定可靠，能夠真是反映產品的內在質量，操作簡單，適合產業化的日常檢 驗工作。
[0006] 本發明的一種喘可治注射液黃酮類有效成分檢測方法，包括如下步驟：
[0007] (1)對照品溶液的制備：取對照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，用甲 醇或流動相溶解即得；
[0008] (2)內標溶液的制備：取柚皮苷對照品，用甲醇或流動相溶解即得；
[0009] (3)供試品溶液的制備：取喘可治注射液用甲醇或流動相稀釋即得；
[0010] ⑷檢測方法：色譜質譜聯用，所述的色譜條件，色譜柱C18、流動相：乙腈-酸水溶 液；所述的質譜條件，輔助氣化電噴霧離子源ESI、多反應離子監測MRM模式負離子檢測。
[0011] 進一步優選步驟（1)中所述的對照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷分 別配置成lmg/ml的對照品貯備液；再分別精密量取對照品儲備液置于同一量瓶中，加入甲 醇稀釋配制成朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均為1000ng/ml的混合對照品儲備 液。
[0012] 更進一步優選步驟（1)所述的對照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷各 約5mg，精密稱定，分別置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成4種對照品儲備 液；再分別精密量取4種對照品儲備液置于同一 IOml量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度配制成 朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均為1000ng/ml的混合對照品儲備液。
[0013] 上述步驟（2)中內標溶液的制備，進一步地，步驟（2)所述的柚皮苷對照品配制成 lmg/ml的內標備液，通過稀釋步驟配制成2μ g/ml內標溶液。
[0014] 上述步驟⑵中所述的稀釋步驟是指取內標儲備液置于量瓶中，加入甲醇或流動 相配制成100 μ g/ml內標次級儲備溶液，精密吸取內標次級儲備液置于量瓶中，加入甲醇 或流動相配制成2 μ g/ml內標溶液。
[0015] 進一步地，步驟（2)取柚皮苷對照品約10mg，精密稱定，置于IOml量瓶中，加甲 醇溶解并稀釋至刻度，配制成內標儲備液。精密量取內標儲備液適量，置IOml量瓶中，加 入流動相稀釋至刻度，搖勻，得1〇〇μ g/ml內標次級儲備溶液。精密吸取內標次級儲備液 200 μ 1，置IOml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到內標工作液（2 μ g/ml)。
[0016] 本發明步驟（3)所述供試品制備，進一步地，用流動相稀釋喘可治注射液，精密量 取1000-2000 μ 1并加入1/5倍內標溶液混合均勻，濾膜，取續濾液，得供試品溶液。
[0017] 更進一步，步驟（3)用流動相稀釋喘可治注射液2000倍，精密量取1000 μ 1加內 標工作液200 μ 1，渦旋40s，過0. 22 μ m濾膜，取續濾液，得供試品溶液。
[0018] 本發明所述的步驟⑷檢測方法，其中所述的色譜條件：C18色譜柱 (50-150) X2. 1mm，粒徑3. 0~5. Oym ;流動相：乙腈：0. 1~1%甲酸水溶液，等度洗脫 (30-40:60-70)進樣量：5~20μ L，柱溫：35~45°C，流速0· 2~0· 3mL/min。所述的質 譜條件：輔助氣化電噴霧離子源ESI ;多反應離子監測MRM模式負離子檢測，監測離子對 分別為：m/z 883. 4 - 675. 2 朝藿定 A，m/z 853. 5 - 645. 3 朝藿定 B，m/z 867. 4 - 659. 4 朝藿定C，m/z 721.3 -513. 2淫羊藿苷，m/z 579. 2 - 271. 1柚皮苷，輔助氣化氣流量： 7000~8000CC/min，霧化氣流量：6~10L/min，氣簾氣流量：5~8L/min，離子源噴霧電 壓：-3800~-4500V，離子源霧化溫度：350-400°C。
[0019] 上述步驟（1)-⑷中所述的流動相是乙腈-0.1~1%酸水溶液，所述的酸包括但 不限于為甲酸、乙酸中一種或以上。優選流動相為乙腈-〇. 1%甲酸水溶液。
[0020] 本發明最佳的檢測方法，包括如下步驟：
[0021] (1)對照品溶液的制備：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷加甲醇溶解并稀 釋至刻度，配制成4種lmg/ml對照品儲備液。分別精密量取4種黃酮對照品儲備液適量， 置IOml量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品儲備液；
[0022] (2)內標溶液的制備：取柚皮苷對照品，精密稱定，置于量瓶中，加甲醇溶解并稀 釋至刻度，配制成lmg/ml內標儲備液。精密量取內標儲備液適量，置于量瓶中，加入乙 腈：〇. 1 %甲酸水溶液（35:65)稀釋至刻度，搖勻，得100 μ g/ml內標次級儲備溶液。精密吸 取內標次級儲備液置量瓶中，加乙腈：〇. 1 %甲酸水溶液（35:65)稀釋至刻度，搖勻，得到內 標工作液（2 μ g/ml);
[0023] (3)供試品溶液制備：用乙腈：0. 1%甲酸水溶液（35:65)稀釋喘可治注射液2000 倍，精密量取1000 μ 1加內標工作液200 μ 1，渦旋40s，過0. 22 μ m濾膜，取續濾液，得供試 品溶液；
[0024] (4)檢測條件：
[0025] 色譜條件
[0026] 色譜柱(：18150父2.1臟，5.(^111、流動相乙腈：0.1%甲酸水溶液35 :65、等度洗脫 3. 5min、進樣量 10 μ 1、柱溫 40°C、流速 0· 22ml/min ;
[0027] 質譜條件
[0028] 輔助氣化電噴霧離子源ESI ;多反應離子監測MRM模式負離子檢測，監測離子對分 別為：111/2 883.4 - 675.2朝藿定六，111/2 853.5 - 645.3朝藿定8，111/2 867.4 - 659.4朝藿 定(：，111/2 721.3 - 513.2淫羊藿苷，111/2 579.2 - 271.1柚皮苷，輔助氣化氣流量：7500〇：/ min，霧化氣流量：8L/min，氣簾氣流量：6L/min，離子源噴霧電壓：-4000V，離子源霧化溫 度：350°C。
[0029] 有益效果
[0030] 為了更好的闡述本發明的有益效果，通過下述試驗證明
[0031] 試驗例一、方法學考察
[0032] 1材料、試劑與儀器
[0033] I. 1標準品
[0034] 朝藿定A (批號：121106,純度：98.8%) 上海融禾醫藥科技有限公司 朝藿定B (批號：121109,純度：98.6%) 上海融禾醫藥科技有限公司 朝藿定C (批號：111780-200801,純度：99.1%)中國藥品生物制品檢定所 淫羊藿苷（批號：0737-9910，純度：98.5%) 中國藥品生物制品檢定所 柚皮苷（批號：0722-200108,純度：99.7%) 中國藥品生物制品檢定所
[0035] 它們的化學結構式見圖1。
[0036] 1. 2 試劑
[0037] 甲醇（色譜級美國Fisher Scientific公司）、乙腈（色譜級美國Fisher Scientific公司）甲酸廣州化學試劑廠、純水、超純水（Milli-Elix, Milli-Q制水系統）
[0038] L 3供試品
[0039] 喘可治注射液（批號：13052501,13052801，13052601，11121001，13022502， 13052702, 12081502,13052902,13042702,12072001,12092301,12071902,13053002, 13030102，20110305)由廣州萬正藥業有限公司提供。
[0040] 1. 4 儀器
[0041] APBOOO型液相色譜-三級四重桿質譜聯用儀 美國AB公司 Milli-Elix，Milli-Q 制水系統 ：? 11、:丨 Millipore 公， PL303電子天平（千分之一)