一種基于絲網印刷碳電極的傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于絲網印刷碳電極的傳感器的制備方法及應用，屬于生物傳感器技術領域。
【背景技術】
[0002]農藥是重要的農業生產資料，在農產品生產中對病、蟲、草、鼠危害的防治起到非常重要的作用。但是，農藥污染及其產生的危害后果是嚴重的，農藥對環境污染造成的損失是多方面的，包括對水環境的污染，對土壤的污染，對大氣的污染，對環境生物的影響以及對人體健康的危害等。目前由于使用者普遍缺乏科學使用農藥知識，片面追求產量，造成目前市場上流通的農業產品都不同程度地存在農藥殘留問題，其危害也日益引起公眾的關注。我國是一個農業大國，隨著我國人民生活水平不斷提高，農產品的質量安全問題越來越受到關注，尤其蔬菜中農藥殘留問題已經成為公眾關注的焦點。我國生產和使用的殺蟲劑絕大多數品種為有機磷和氨基甲酸酯類農藥(約占70% )，其中高毒性的有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑為70%左右，因此容易引起食物農藥殘留中毒。可見，加強對農產品中農藥殘留的檢測對保護生態環境，尤其是保障人類健康有著十分深遠的意義，而農藥殘留檢測的重點應該放在有機磷和氨基甲酸酯類農藥。
[0003]目前農藥殘留分析的主要方法是氣相色譜儀、液相色譜儀、氣質聯用儀等，這些方法雖然分析精度高，定量準確，但其樣品的前處理復雜、檢測耗時長、成本高、需要技術熟練的操作人員。我國農藥殘留的速測方法是酶抑制試紙法和酶抑制分光光度法(農殘快速檢測儀)，可以實現有機磷農藥及氨基甲酸酯類農藥的現場快速檢測，具有較好的實用價值。速測卡是通過肉眼觀察卡片的顏色變化，因此一般只能用于嚴重超標的蔬菜樣品進行定性測量。酶抑制分光光度法的應用也比較廣泛，國內已有多種農藥殘留速測儀均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的變化進行檢測的，但蔬菜水果中大量的色素會對分光光度法造成很大的影響，導致檢測結果的不準確。并且上述方法存在回收率低、錯檢、漏檢比例較高、重復性差、難以滿足低殘留和定量檢測的要求等缺點。電化學傳感器的實際應用中，因為實際樣品的復雜性，傳感器存在著“電極中毒”的現象，使傳感器的表面容易受到破壞，因此，近年來普遍研宄一次性傳感器以消除檢測過程對于電極本身的污染。
[0004]殼聚糖具有優良的官能性和相容性，可以作為固定大分子蛋白質的材料，用來制備穩定性和靈敏度高的電化學生物傳感器。多壁碳納米管是一種完美的碳納米材料，具有特殊熱性能和機械性能，并且具有高比表面積和優異的導電性。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服上述現有技術存在的不足，提供了一種結構簡單、操作方便、成本低且檢測靈敏度高的絲網印刷電極生物傳感器制備方法，采用的技術方案如下:
[0006]一種基于絲網印刷碳電極的傳感器的制備方法，其特征在于:是將制備好的多壁碳納米管(MWCNTs)-二氧化錫(Sn02)_殼聚糖(CHIT)復合物滴涂到經過清洗活化的絲網印刷碳電極(SPE)表面，獲得修飾電極，再將乙酰膽堿酯酶(AChE)滴涂到修飾電極的表面，干燥清洗后獲得基于絲網印刷碳電極的乙酰膽堿酯酶生物傳感器(AChE/MWCNTs-Sn02-CHIT/SPE)。
[0007]所述方法步驟為:
[0008]I)制備多壁碳納米管-二氧化錫-殼聚糖復合物；
[0009]2)清洗、活化絲網印刷碳電極，獲得預處理絲網印刷碳電極；
[0010]3)將步驟I)制備的多壁碳納米管-二氧化錫-殼聚糖溶液滴涂在步驟2)的預處理絲網印刷碳電極表面上，得到修飾碳電極；
[0011]4)將乙酰膽堿酯酶滴涂到步驟3)所得修飾電極的工作電極表面上，干燥清洗后獲得基于絲網印刷碳電極的乙酰膽堿酯酶生物傳感器。
[0012]步驟2)所述絲網印刷碳電極，包括印制電極的基片，印制于基片上的外部絕緣層和至少兩根電極引線，基片印制有三個電極，分別為一個工作電極、一個對電極及一個參比電極，各電極對應連接有一電極引線。
[0013]步驟2)所述清洗、活化絲網印刷碳電極，過程是:首先，將絲網印刷碳電極置于NaOH溶液中超聲，超純水沖洗，N2吹干，其次，將電極置于HCl溶液中超聲，超純水沖洗，N2吹干，再次，用無水乙醇沖洗電極，N2吹干，最后，在磷酸鹽緩沖液中掃描電流-時間曲線，之后掃描循環伏安曲線直至性能穩定。
[0014]步驟3)所述在預處理電極表面滴涂多壁碳納米管-二氧化錫-殼聚糖溶液，是將5?10 μ L的多壁碳納米管-二氧化錫-殼聚糖納米復合物滴涂在預處理絲網印刷碳電極上，在空氣中干燥，用超純水沖洗表面，將未固定在電極表面的復合物沖洗掉，得到多壁碳納米管-二氧化錫-殼聚糖修飾的絲網印刷碳電極。
[0015]步驟4)所述在工作電極上滴涂乙酰膽堿酯酶，是滴涂5?10 μ L的IU/ μ L乙酰膽堿酯酶溶液，并在4°C下干燥2h，之后用pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液沖洗去除未吸附上的酶，得到乙酰膽堿酯酶生物傳感器。
[0016]所述方法具體步驟如下:
[0017]I)在50mL 1.0%乙酸溶液中加入0.1g殼聚糖，配制成0.2%殼聚糖溶液，將3mg多壁碳納米管和Img二氧化錫加入到4mL新配制的0.2%殼聚糖溶液中，通過超聲處理直到均勻分散，將制備好的多壁碳納米管-二氧化錫-殼聚糖納米復合物在4°C下存儲；
[0018]2)將絲網印刷碳電極置于ImM NaOH溶液中超聲5min，超純水沖洗，N2吹干，將電極置于ImM HCl溶液中超聲5min，超純水沖洗，N2吹干，用無水乙醇沖洗電極，N2吹干，在pH5.0磷酸鹽緩沖液中掃描電流-時間曲線300s，掃描循環伏安曲線直至性能穩定，得到預處理絲網印刷碳電極；
[0019]所述絲網印刷碳電極，包括印制電極的基片，印制于基片上的外部絕緣層和至少兩根電極引線，基片印制有三個電極，分別為一個工作電極、一個對電極及一個參比電極，各電極對應連接有一電極引線。
[0020]3)將5?10 μ L的步驟I)制備的多壁碳納米管-二氧化錫-殼聚糖納米復合物滴涂在步驟2)所得的預處理絲網印刷碳電極上，在空氣中干燥，用超純水沖洗表面，將未固定在電極表面的復合物沖洗掉，得到多壁碳納米管-二氧化錫-殼聚糖修飾的絲網印刷碳電極；[0021 ] 4)滴涂5?10 μ L的IU/ μ L乙酰膽堿酯酶溶液到步驟3)所得修飾電極的工作電極表面上，并在4°C下干燥2h，用pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液沖洗去除未吸附上的酶，獲得乙酰膽堿酯酶生物傳感器，在4°C干燥環境下保存備用。
[0022]本發明所述方法適用于檢測有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥，尤其適合用于檢測毒死蜱的檢測。
[0023]所述方法，其特征在于:多壁碳納米管-二氧化錫-殼聚糖納米復合物的合成，絲網印刷碳電極的清洗，乙酰膽堿酯酶傳感器敏感界面的構建及過程表征，乙酰膽堿酯酶傳感器工作曲線的建立，乙酰膽堿酯酶傳感器性能的檢測，乙酰膽堿酯酶傳感器對實際樣品的檢測。乙酰膽堿酯酶傳感器性能檢測包括準確性、穩定性以及乙酰膽堿酯酶傳感器對樣品回收率的測定。
[0024]所述制備方法，其特征在于:所制備的電流型乙酰膽堿酯酶傳感器檢測毒死蜱的濃度范圍為0.05?I X 15 μ g/L，檢測限為0.05 μ g/Lo
[0025]所述方法制備原理為:由于有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥與乙酰膽堿酯酶具有較高的特異性結合，因此常用乙酰膽堿酯酶作為檢測有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥的分子識別元件。乙酰膽堿酯酶生物傳