一種用于檢測胃泌素-17的試劑盒及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物物質檢測的技術領域，具體涉及一種用于檢測胃泌素-17的試劑 盒及其制備方法，以及應用該試劑盒檢測胃泌素-17的方法。
【背景技術】
[0002] 胃泌素是一種重要胃腸激素，由存在于胃幽門部粘膜的G細胞（gastrin containingcell)分泌，然后進入血中再作用于胃，進而促進胃液分泌。G細胞主要分布在 胃竇部，并在腎臟代謝，腎功能不全時血清胃泌素升高。胃的幽門竇受到食物等的機械性刺 激，幽門部的pH偏堿性時就進行胃泌素的分泌。其結果是胃液、特別是鹽酸的分泌變得旺 盛。當胃內部的pH降低時，鹽酸和胃泌素的分泌就停止。此外，胃泌素也具有促進胃蛋白 酶、胰液、膽液、胰島素等分泌的作用，可是這些作用并不強。
[0003] 由于胃泌素原的細胞轉譯成熟，竇中的G細胞在循環中開始釋放一些不 同種類的、由酸刺激產生的胃泌素及其他前體的混合物質。這個混合物質由胃泌 素-71、-52、-34、-17、-14、-6組成，其中在健康人血清/血衆中主要存在形式為胃泌素-34 和胃泌素-17。胃泌素-17(G-17)是健康竇粘膜中最主要有效形式，基本完全由G細胞產 出。胃泌素-17系由17個氨基酸殘基組成的多肽，有兩種：酪氨酸殘基上為硫酸基取代的 和未被取代的（胃泌素I和II)，但是這兩種形式在生理活性上并沒有差異。僅在相當于C 末端部分的四肽（Tyr-Met-Asp-Phe-Mg發現胃泌素的活性，稱為四肽胃泌素。對各種哺 乳類動物的胃泌素的一級結構的研宄表明，胃泌素-17均為17個氨基酸組成，僅從氨末端 的第5位和第10位的氨基酸因動物而異。另外，所有12位的酪氨酸結合著-S03H是胃泌 素-17的重要特征之一。
[0004] 幽門螺桿菌感染繼發萎縮性胃炎的患者一般有著異常低的胃泌素-17水平，相對 應地，其胃癌和消化性潰瘍疾病的風險增加到普通人的18倍和25倍。胃泌素-17在胃十二 指腸潰瘍的發病機制中起到基本或重要的作用。對于這類患者，在基礎狀態下，血清胃泌素 偏高，平均水平大約為160pg/ml，與正常范圍可有一定重疊；但在進食及其他刺激胃泌素 分泌的情況下則明顯增高。高胃泌素是胃潰瘍的重要發病機制之一。另外，異常高的胃泌 素-17水平可以視作胃酸缺乏癥的標志。胃泌素-17檢測也可以作為病人的術后監測指標， 做過成功的胃竇切除手術后，胃泌素-17分泌水平基本接近于0。在胃泌素瘤即卓林格-艾 里森（Zollinger-Ellison)綜合癥患者的血液中，胃泌素-17濃度偏高。胃泌素瘤是胰腺 最常見的內分泌腫瘤，是胰島中分泌胃泌素的D細胞增生而發病，其分泌大量胃泌素，使壁 細胞急劇增加。胃泌素瘤其次發生在胃和十二指腸。卓-艾綜合征具下列三聯癥：高胃泌 素血癥，可高達l〇〇〇pg/ml;高胃酸排出量，基礎胃酸> 15mmol/h，可達正常人的6倍；伴有 反復發作的胃、十二指腸多處潰瘍，且多為難治性潰瘍，伴慢性腹瀉。
[0005] 目前胃泌素-17的檢驗在臨床上使用越來越廣泛，市場上主要使用的檢測方法為 酶聯免疫吸附試驗法（ELISA)。
[0006] 酶聯免疫吸附試驗法是指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上， 利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。主要檢測原理為免疫夾心 法：其中一株胃泌素-17特異性捕捉抗體吸附于包板上，另一株檢測抗體則標記辣根過氧 化物酶（HRP)。通過HRP連單抗與胃泌素-17結合到固相載體上，溫育清洗，后加入底物， HRP催化底物發生顯色反應，最終通過酶標儀測定其吸光度，從而計算樣本胃泌素-17的濃 度。
[0007] 酶聯免疫吸附試驗法檢測時間長，至少需要6個小時，甚至過夜反應才能完成測 試；同時主要依靠純手工加樣等系列操作，效率低，容易導致實驗結果誤差大；由于酶促反 應不夠徹底，且易受外部干擾因素影響，如溫度、時間及材料濃度影響，因此檢測時特異性 低，靈敏度差。并且，酶聯免疫吸附試驗法的固相載體為固態，均勻涂布于酶標板反應孔內， 在測試前需將待測樣本預稀釋，增加了實驗難度，進一步降低了試劑的靈敏度和準確性。
[0008] 另外，目前市場上也有檢測胃泌素全片段的方法，主要為放射免疫分析法（RIA)、 化學發光免疫分析法（CLIA)。雖然檢測胃泌素全片段能夠在檢測臨床胃泌素含量時防止漏 檢，但是胃泌素成份過于復雜，并不是每一個成份都能用于臨床疾病的檢驗及診斷；并且在 檢測胃泌素全片段時使用的多抗會嚴重降低試劑的特異性及靈敏度，造成檢測結果的不準 確。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于提供一種檢測胃泌素-17的試劑盒及其制備方法，利用胃泌 素-17與胃泌素-17抗體的特異性結合，結合示蹤標記物的發光性能和磁球的磁性，該試劑 盒能夠準確地測定樣本中的胃泌素-17含量。
[0010] 本發明的目的還在于提供一種檢測胃泌素-17的方法，利用本發明提供的試劑 盒，根據雙抗體夾心法原理或競爭法原理，準確地測定樣本中的胃泌素-17含量。尤其是采 用該試劑盒，通過全自動化學發光法檢測胃泌素-17,能夠減少操作時間，降低人為操作誤 差。
[0011] 根據本發明，提供了一種用于檢測胃泌素-17的試劑盒，所述試劑盒包括組分A和 組分B，其中組分A為標記有示蹤標記物或包被磁球的第一抗胃泌素-17抗體，組分B為包 被磁球或標記有示蹤標記物的第二抗胃泌素-17抗體或（包被磁球或標記有示蹤標記物 的）胃泌素-17 ;并且，組分A和組分B中的任意一種標記有示蹤標記物，另一種則包被磁 球；所述第一抗胃泌素-17抗體和第二抗胃泌素-17抗體與胃泌素-17的結合位點不同。
[0012] 在本發明中，所述第一抗胃泌素-17抗體和第二抗胃泌素-17抗體的區別在于它 們與胃泌素-17的位點結合不同。在本發明的試劑盒中，例如當所述第一抗胃泌素-17抗 體包被磁球時，其用以結合待測樣品中的胃泌素-17,那么標記有示蹤標記物的第二抗胃泌 素-17抗體用以與胃泌素-17上不同于其與第一抗胃泌素-17抗體的結合區域的另一區域 相結合。
[0013] 應理解，在本發明所提供的試劑盒中，所述第一抗胃泌素-17抗體可以為一個或 多個抗胃泌素-17抗體，第二抗胃泌素-17抗體可以為一個或多個抗胃泌素-17抗體，只要 構成所述第一抗胃泌素-17抗體的一個或多個抗胃泌素-17抗體與構成第二抗胃泌素-17 抗體的一個或多個抗胃泌素-17抗體分別能夠與胃泌素-17上的不同結合區域結合。
[0014]根據本發明，所述第一抗胃泌素-17抗體和第二抗胃泌素-17抗體可以是抗胃泌 素-17單克隆抗體和/或抗胃泌素-17多克隆抗體。
[0015] 人體中，95%以上有生物活性的胃泌素是d-酰胺化胃泌素，其中80% -90%是胃 泌素-17。單純的檢測胃泌素-17時使用特異性極高的單克隆抗體能夠擁有更好的特異性 及靈敏度，并且檢測方法簡單。因此，本發明提供了測定體內胃泌素-17含量的試劑盒，通 過試劑盒測定胃泌素-17含量來反映臨床上不同病癥的發生。
[0016] 根據本發明，所述示蹤標記物可以選自本領域中常用于標記抗原或抗體的示蹤標 記物，例如金剛烷、魯米諾及其衍生物、異魯米諾及其衍生物、叮啶酯、堿性磷酸酶（ALP)或 辣根過氧化物酶（HRP)，尤其優選為N- (4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)。
[0017] 適用于本發明的磁球也稱為磁珠，可以是本領域中常用的磁性微球。優選的是，本 發明使用的磁球，是將納米級的Fe203或Fe304磁性粒子和有機高分子材料進行復合，形成具 有超順磁性和極大量蛋白吸附容量的微米級的固相微球，具有在外加磁場作用下可迅速被 磁化，在撤走磁場后剩磁為零的屬性。其中，所述有機高分子材料的種類沒有特別限制，可 根據需要進行選擇。
[0018] 本發明所使用的磁性微球應能滿足直徑為0.1-5y m，磁性微球還可以通過表面改 性而帶有多種活性功能基團，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。
[0019] 在一個具體實施例中，所述磁球為Fe203或Fe 304磁性納米粒子與有機高分子材料 的復合體，并具有〇. 1-5ym的粒徑；并且，所述磁球任選地通過表面改性而帶有一種或多 種活性功能基團。
[0020] 根據本發明，在所述試劑盒中，第一抗胃泌素-17抗體的濃度為10-200yg/L，第 二抗胃泌素-17抗體或胃泌素-17的濃度為10-200yg/L，示蹤標記物的濃度為0. 1-lmg/ L，磁球的濃度為0.l_5mg/ml。上述各成分的濃度基于包含該成分的各獨立的試劑盒組分的 量計。
[0021] 根據本發明，所述試劑盒還包括胃泌素-17的低點校準品和高點校準品，并任選 地包括緩沖液。本發明所述低點校準品與高點校準品是兩者相對而言，其中"低點校準品"， 是指將胃泌素-17用50%牛血清制品稀釋成濃度為10-30ng/ml得到的校準品；而"高點校 準品"是指將胃泌素-17用50%牛血清制品稀釋成濃度為500-700ng/ml得到的校準品。低 點校準品和高點校準品分別任選地含有牛血清白蛋白（BSA)和/或防腐劑。所述BSA的濃 度優選為 0.01-0. 5g/ml。
[0022] 在本發明的一些實施方案中，所述組分B為包被磁球或標記有示蹤標記物的第二 抗胃泌素-17抗體。
[0023] 在這些實施方案中，所述示蹤標記物直接或間接地標記第一抗胃泌素-17抗體或 第二抗胃泌素-17抗體。間接標記的方式包括但不限于通過異硫氰酸熒光素（FITC)與抗 FITC抗體體系或通過鏈霉親和素（SA)與生物素（Biotin)體系進行間接標記。直接標記 是指ABEI直接與第一抗胃泌素-17抗體或第二抗胃泌素-17抗體連接進行標記；間接標記 是指通過中間媒介鏈接體系使得ABEI標記第一抗胃泌素-17抗體或第二抗胃泌素-17抗 體，所述中間媒介鏈接體系包括但不限于FITC與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素 體系。所述抗FITC抗體優選為羊抗FITC多克隆抗體。
[0024] 在這些實施方案中，所述第一抗胃泌素-17抗體或第二抗胃泌素-17抗體直接或 間接地包被磁球。間接包被磁球的方式包括但不限于通過FITC與抗FITC抗體體系或通過 鏈霉親和素與生物素體系進行間接包被。直接包被是指利用第一抗胃泌素-17抗體或第二 抗胃泌素-17抗體直接對磁球進行包被；間接包被是指通過中間媒介鏈接體系，使得第一 抗胃泌素-17抗體或第二抗胃泌素-17抗體對磁球進行包被，所述中間媒介鏈接體系包括 但不限于FITC與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系。
[0025] 在一個具體實施方案中，胃泌素-17檢測試劑盒包括如下組分：1)標記第一抗胃 泌素-17抗體的示蹤標記物溶液，第一抗胃泌素-17抗體濃度為10-200yg/1，示蹤標記物 濃度為〇. 1-lmg/l;2)包被有第二抗胃泌素-17