一種il-12檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種與復發性流產相關的IL-12檢測試劑 盒。所述試劑盒屬于Alphalisa-均相化學發光檢測技術，本發明的檢測試劑盒可以反映體 機細胞免疫功能狀態，用于復發性自然流產病因篩查，輔助診斷復發性自然流產，以及復發 性自然流產免疫調節治療中的治療反應性監測等，作為個體化綜合治療中關鍵循證醫學依 據。
【背景技術】
[0002] 復發性自然流產（recurrentspontaneousabortion,RSA)是指連續發生2次或2 次以上自然流產者，發病率約占妊娠總數的1-5%，嚴重影響人類生殖健康。RSA的病因復 雜，約50%與染色體異常、生殖系統解剖結構異常、內分泌失調及感染等因素有關，另50% 左右原因不明，而經過近20年的發展，逐漸明確80%以上所謂的原因不明RSA都與免疫因 素相關，免疫因素參與人類生殖各階段的功能調控，包括受精、胚胎植入、胎盤形成、胎兒發 育及分娩等。
[0003] 妊娠被視為一種獨特的半同種異體移植過程，成功妊娠意味著母體免疫系統對胚 胎抗原的免疫耐受：調節性T細胞（regulatoryTcells,Treg)擴增；母體Th2型免疫優 勢；滋養細胞Fas配體（FasL)豐度表達；抑制性信號（PD-Ll，Stat3和TGF-0)和協同刺激 分子（CD80和CD86)之間的平衡；一氧化氮（N0)，乳糖凝集素（galectin-1)和吲哚胺雙加 氧酶（indoleamine2,3_dioxygenase，ID0);滋養細胞高表達HLA-G;此外，B細胞、Thl7 細 胞及存在于外周血與子宮內膜的自然殺傷細胞（naturalkillercells，NK)功能調控等均 是母胎免疫耐受及成功妊娠的關鍵。這種耐受機制的失調可導致母體對胚胎的免疫排斥， 在臨床上主要表現為反復胚胎移植失敗（recurrentimplantationfailure,RIF)、RSA、胎 兒宮內發育遲緩（intrauterinegrowthretardation,IUGR)和子癇等病理妊娠。
[0004] IL- 12是細胞介導免疫中非常重要的細胞因子。其主要免疫調節作用是誘導早 期輔助性T母細胞（Thnaive)分化為Thl細胞，并促進Thl細胞的發育和增殖。輔助性T細 胞（helperTcell，Th)是細胞介導免疫應答和B淋巴細胞產生抗體所必需的，可分為Thl 和Th2兩個亞群。前者產生IL-2、IL-3、IFN-丫和淋巴毒素及粒細胞2巨噬細胞集落刺激 因子（granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，GM_CSF)等，參與細胞免疫； 而后者則產生IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等細胞因子，輔助B細胞產生抗體，參與體液免 疫。IL一 12能促進T細胞和NK細胞的增殖。對外周血分離T細胞、培養T細胞克隆、CTL 細胞系和TIL細胞都有啟動生長增殖效應，IL一 12還可刺激⑶4+和⑶8+的TCR-a0+T 細胞或TCR-yS+淋巴母細胞的增殖，而IL-2抗體或受體不能抑制其增殖，因此這一效應 不依賴于IL-2。說明IL一 12效應獨立于IL-2。。IL一 12還可刺激NK細胞和T細胞產生 IFN-y，發揮免疫調節功能。
[0005] IL-12在正常人體內含量極低（小于100ng/L)，目前市場上的檢測方法均為ELISA 法，比如R&D公司的IL-12ELISA試劑盒檢測靈敏度為15ng/L，線性區間為31. 2-2, 000ng/ L，批內CV%大于5. 5。對于低于31. 2ng/L和高于2,OOOng/L的患者難以準確測定，需要建 立一種高靈敏寬檢測區間的IL-12的檢測方法。
[0006] Alphalisa是以納米級高分子微球為基礎的新一代化學發光技術，該項技術將被 廣泛地應用于研宄生物分子的相互作用。其主要原理是由光激發產生的均相化學發光技 術。它具有快速、均相（免沖洗）、高靈敏和操作簡單的特點。Alphalisa試劑由含有感光 化合物的供體微球和含有發光化合物的受體微球組成，微球直徑約188nm表面覆蓋多糖水 凝膠。水凝膠能減少非特異性結合，同時，增加微球的懸浮性。微球通過水凝膠表面的功能 團與生物分子共價連接。納米級微球大大增加了反應的表面積，每個微球的表面包被著成 百上千個生物分子，可捕獲目標分子。
[0007] AlphaLISA技術主要依賴于Alpha供體微珠和受體微珠的相互作用。當生物反應 使供體微珠和受體微珠相互接近時，激光激發級聯反應，從而產生極大放大的信號。具體 來說，在680nm的激光照射下，供體微珠上的光敏劑將周圍環境中的氧氣轉化為更為活躍 的單體氧。單體氧擴散至受體微珠，產生一系列的化學發光反應，最后將能量傳遞到銪，發 射波長為615nm。在生物分子不存在特異的互相作用時，單體氧無法擴散到受體微珠，則不 會有信號的產生。
【發明內容】
[0008] 鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種與復發性流產相關的 IL-12檢測試劑盒及其使用方法和用途，用于解決現有技術中的問題。
[0009] 為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種與復發性流產相關的 IL-12檢測試劑盒，包括抗IL-12抗體包被的受體微球、生物素標記的抗IL-12抗體和親和 素包被的供體微球。
[0010] 優選的，所述檢測試劑盒還包括IL-12抗原標準品。
[0011] 更優選的，所述IL-12抗原標準品為凍干品。在使用時加入分析緩沖液，配置成對 應的濃度范圍。
[0012] 更優選的，所述IL-12抗原標準品的濃度范圍為0-2000ng/L。
[0013] 本發明一優選實施例中，分析緩沖液的配置為：pH7.4的25mMHEPES，0. 5% TritonX-100,0? 1 %干酷素，lmg/mL葡聚糖 500。
[0014] 在本發明一優選實施例中，IL-12抗原標準品共6瓶，IL-12濃度分別為：0ng/L， lng/L，25ng/L，50ng/L，1000ng/L，2000ng/L。
[0015] 優選的，所述檢測試劑盒還包括微孔板。
[0016] 更優選的，所述微孔板為白色不透明微孔板。
[0017] 優選的，所述檢測試劑盒還包括分析緩沖液。
[0018] 優選的，所述抗IL-12抗體包被的受體微球中，受體微球為Alpha受體微球，IL-12 抗體與受體微球按重量比1 :45-55進行包被。即抗IL-12抗體包被的受體微球的制備過程 中，所加入的IL-12抗體與受體微球的重量比為1 :45-55。
[0019] 更優選的，所述Alpha受體微球直徑為166-210nm，表面覆蓋多糖水凝膠。
[0020] 在本發明一優選實施例中，所述Alpha受體微球由perkinelmer公司 (Massachusetts，USA)提供。
[0021] 微球表面的水凝膠能減少非特異性結合，同時，增加微球的懸浮性。微球通過水凝 膠表面的功能團與生物分子共價連接。納米級微球大大增加了反應的表面積，每個微球的 表面包被著成百上千個生物分子，可捕獲目標分子。
[0022] 優選的，所述抗IL-12抗體包被的受體微球的制備方法，包括如下步驟：
[0023] 1)將洗滌后的Alpha受體微球5mg和抗IL-12抗體0?lmg混合，加入適量的磷酸 緩沖溶液，使最終反應量達到200yL;適量吐溫20水溶液和NaBH3CN水溶液；
[0024] 2)在 35-39°C下孵育 18-24 小時；
[0025] 3)在反應體系中加入封閉液封閉未反應的位點，在35_39°C下孵育，孵育時間多1 小時；
[0026] 4)離心去除上清液，將微球溶于Tris-HCl溶液中；
[0027] 5)離心之后即得所述抗IL-12抗體包被的受體微球。
[0028] 將所得抗IL-12抗體包被的受體微球溶于儲存緩沖溶液中，并對微球溶液進行渦 流和超聲后，即得抗IL-12抗體的受體微球溶液，置于4°C下保存。
[0029] 在本發明一優選實施例中，微球以5mg/mL溶于儲存緩沖溶液中，所述儲存緩沖溶 液為PBS緩沖液，所述P