一種用于糖蛋白檢測的電化學方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種糖蛋白的檢測方法，特別涉及一種用于糖蛋白檢測的電化學方法，屬于化學領域。
【背景技術】
[0002]糖蛋白是一類重要生理活性物質，參與很多生命活動過程及代謝調節，起著多種重要的作用。一些蛋白表面糖基化的變化通常關聯和預示著一些疾病的發生，例如一些與癌癥有關的糖蛋白近年來就發現可能具有一定的關聯性，通過分析和檢測糖蛋白有助于生命科學的研究和發展。為此在業界也在積極尋找和開拓高效、低成本糖蛋白檢測方法，近年來電化學傳感器檢測方法發展迅速，在糖蛋白檢測方面“夾心式”傳感器(如酶聯免疫吸附法)是檢測蛋白質的一種有效方法。在這種檢測體系中，目標蛋白質可以被電極表面的抗體(一抗)捕獲，然后再通過酶標記的抗體(二抗)對被捕獲的蛋白質進行識別和信號輸出。然而，抗體和酶標記抗體往往價格較高、制備較困難，且容易變性。電化學傳感器具有使用方便、測量精度高、維護簡單和成本低等優點，在生物分析中具有廣大的應用前景。因此，開發研制一種用于糖蛋白的高靈敏和選擇性檢測的電化學傳感器是十分必要的。
【發明內容】
[0003]本發明為提供一種用于糖蛋白檢測的電化學方法。
[0004]一種用于糖蛋白檢測的電化學方法，包括以下步驟:
(A)制備苯硼酸-生物素-納米金復合物，包括以下子步驟:
Al:納米金粒子的合成，采用前驅體為HAuCl4,還原劑為檸檬酸鈉，將HAuCl4溶液加熱至沸騰，然后快速加入檸檬酸鈉溶液，繼續加熱沸騰10-50分鐘，然后將溶液冷卻到室溫，即得到檸檬酸穩定的納米金粒子溶液；
A2:苯硼酸-生物素-納米金復合物的合成:用移液槍取出上述納米金粒子溶液，然后加入包含三(2-羧乙基)膦和多肽的PBS溶液，PBS溶液的pH為7-8，室溫攪拌I小時以上得到生物素修飾的納米金，再向反應溶液中加入4-巰基苯硼酸溶液，繼續攪拌0.5小時以上得到苯硼酸-生物素-納米金復合物；
A3:苯硼酸-生物素-納米金復合物的純化:將A2得到的反應產物離心分離，棄除上層未反應的多肽和三(2-羧乙基)膦，將所得沉淀物用pH =7-8的PBS溶液洗滌，將得到的純化后的苯硼酸-生物素-納米金復合物用PBS溶液分散，低溫保存備用；
(B)工作電極的制備，包括以下子步驟:
B1:在金電極表面組裝巰基化的核酸適配體；
B2:采用6-巰基己醇和牛血清蛋白封閉未反應的金電極表面；
B3:將含糖蛋白的待測物修飾到B2得到的電極表面；
B4:將步驟A制備得到的的苯硼酸-生物素-納米金復合物修飾到B3得到的電極表面； B5:將鏈霉親和素-堿性磷酸酶復合物修飾到B4得到的電極表面；
B6:將B5得到的電極浸泡于p-APP溶液中，催化產生電活性物質對氨基酚；
(C)電化學測試:將步驟(B)制備得到的電極作為工作電極進行電性能測試。
[0005]進一步的，步驟A2和A3中所述的PBS溶液的pH值為7.4，進一步的，步驟BI中所述的核酸適配體為:5’ -SH- (CH2) 6-GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA,進一步的，步驟(C)中電化學測試采用三電極體系，制備的金電極作為工作電極，飽和的Ag/AgCl電極為參比電極，Pt電極為輔助電極，進一步的，步驟A3得到的苯硼酸-生物素-納米金復合物低溫保存備用，所述的保存溫度為0°C -8 °C，進一步的，步驟A3得到的苯硼酸-生物素-納米金復合物低溫保存備用，所述的保存溫度為4 V。
[0006]本發明所提供的一種用于糖蛋白檢測的電化學方法的有益技術效果為:糖蛋白富含糖基，而糖基可以和苯硼酸相互作用形成硼酸酯鍵，采用苯硼酸代替二抗來特異性地識別糖蛋白成本低、選擇性高，且本發明對糖蛋白的識別準確性極高，本發明采用核酸適配體捕獲糖蛋白，通過硼酸酯鍵作用，采用苯硼酸-生物素-納米金復合物對糖蛋白進行衍生從而有利于通過生物素-親和素之間的作用將多個鏈霉親和素-堿性磷酸酶復合物分子固定于電極表面，本發明的方法靈敏性高，檢測限低，選擇性好，本發明無需采用價格昂貴、易變性的抗體，成本較低，穩定性好。
【附圖說明】
[0007]圖1是本發明糖蛋白重組人紅細胞生成素為例的測試原理圖。
[0008]圖2是檸檬酸穩定的納米金和苯硼酸-生物素-納米金復合物的紫外-可見吸收光譜圖。
[0009]圖3為苯硼酸-生物素-納米金復合物的透射電鏡表征圖。
[0010]圖4是工作電極在經過和不經過rHuEPO修飾步驟的測試結果圖。
[0011]圖5是修飾不同濃度的rHuEPO時的測試結果圖。
[0012]圖6是峰電流與rHuEPO濃度的線性關系圖。
[0013]圖7是本發明的傳感器的選擇性測試圖。
【具體實施方式】
[0014]為了更充分的解釋本發明的實施，提供本發明的實施實例。這些實施僅僅是對該工藝的闡述，不限制本發明的范圍，本發明中用以下實施例說明，但不限于下述實施例，任何變化實施都包含在本發明的技術范圍內。本發明中各種縮寫所代表的物質分別為:TCEP:三(2-羧乙基)膦，CALNNGK(b1tin)G:多肽，PBS:磷酸鹽緩沖液，MBA:4_巰基苯硼酸，rHuEPO:糖蛋白重組人紅細胞生成素，BSA:牛血清蛋白，MCH:6_巰基己醇，p-APP:4-氨基苯磷酸鹽，SA-ALP:鏈霉親和素-堿性磷酸酶復合物；mM、μΜ、ρΜ、為濃度單位，分別代表 lCT3mol/L、lCT6mol/L、lCT12mol/L, M-L:微升，Tris:英文名稱:Tris (hydroxymethyl)aminomethane，中文別名:三(羥甲基)氨基甲烷；氨丁三醇；緩血酸銨；三羥甲基氨基甲烷。以下實施例以糖蛋白重組人紅細胞生成素作為待測糖蛋白進行具體闡述。圖2中曲線a為檸檬酸穩定的納米金的紫外-可見吸收曲線，曲線b為苯硼酸-生物素-納米金復合物的紫外-可見吸收曲線。圖3為苯硼酸-生物素-納米金復合物的透射電鏡表征圖。圖4中rHuEPO的濃度為10 pM，掃速為0.1 V/s，支持電解質為50 mM Na2SO4，箭頭所示為掃描方向。圖5中脈沖高度為50 mV，脈沖寬度為50 ms，圖6中rHuEPO的濃度依次為0.02, 0.2，0.5，I和2 pM。圖7中是電極對辣根過氧化氫酶(I)，前列腺特異抗原(2)，金屬硫蛋白(3)，鏈霉親和素(4)，凝血酶(5)，rHuEPO (6)及I?6混合物(7)的響應情況。rHuEPO的濃度為I ρΜ，Γ5的濃度均為10 pM，本發明中的核酸適配體5’ -SH-(CH2)6-GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA 為已知物，具體的可見參考文獻 “Analyst，2010，135， 2924-2929”。
實施例1:
(A):苯硼酸-生物素-納米金復合物的合成:
Al:采用體積比為1:3的HN03/HC1混合液將三頸燒瓶、球形冷凝管、量筒清洗干凈，晾干。往三頸燒瓶中加入50 mL I mM的HAuCl4，加熱至沸騰，然后快速加入5 mL 38.8 mM的檸檬酸鈉溶液，繼續加熱沸騰30分鐘，然后將該紅色溶液冷卻到室溫；
A2:用移液槍取出上述納米金溶液5 mL，然后加入5 mL I mM的包含50 μΜ TCEP和2 μΜ CALNNGK (b1tin) G 的 PBS 溶液(pH 7.4)，室溫攪拌 2 小時，再加入 0.1 mL 50 μΜ 的4-巰基苯硼酸溶液(MBA)，繼續攪拌2小時；
A3:將反應物于13000 rpm/min的轉速下離心，棄除上層未反應的CALNNGK (b1tin) G和MBA。將所得的苯硼酸-生物素-納