一種一步薄層層析快速檢測生物胺的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種一步薄層層析快速檢測生物胺的方法，屬于食品分析和安全技術 領域。
【背景技術】
[0002] 生物胺是一類具有生物活性含氮的低分子量有機化合物的總稱；含有蛋白質和氨 基酸的食品，在一定條件下通過氨基酸的脫羧反應或醛的胺化作用便可產生生物胺。目前 已發現水產品、肉制品、干酪及乳制品、酒及各類發酵食品、蔬菜、水果、干果和巧克力等食 品中均含有多種生物胺。過量的生物胺被證明對人體會產生一些不良的生理反應，在食品 保藏學中，生物胺往往是在食品腐爛或發酵過程中產生；組胺和酪胺是存在于食品中含量 最多、也是對人類健康影響最大的兩種生物胺。
[0003] 歐洲食品安全局（EFSA)將歐盟范圍內含大量組氨酸魚制品中組胺的含量制定為 < 100mg/kg或100?200mg/kg ;將用含大量組氨酸魚類制作、在鹽水中經酶熟化處理的制 品組胺含量制定為< 200mg/kg或200?400mg/kg。EFSA對食品中的組胺含量沒有加以 限定，建議上限為l〇〇mg/kg(食品）或2mg/L(含酒精飲料）；美國食品藥品管理局（FDA) 基于組胺500mg/kg的毒性，制定美國國內金槍魚、鬼頭刀及相關魚類中組胺的干預水平為 50mg/kg。同時認為，500?1000mg/kg以上的組胺對人體健康有潛在危險。而對酪胺和苯乙 胺的安全閾值，所給出的建議參考上限分別為100?800mg/kg和30mg/kg ;我國GB2733- 2005《鮮（凍）動物性水產品衛生標準》規定鮐魚中組胺含量應低于1000mg/kg，其他魚類 中組胺含量應低于300mg/kg。
[0004] 目前食品中生物胺的檢測一般采用高效液相色譜（HPLC)，生物傳感器等方法。這 些方法均有一定的應用，也各有優缺點；如最常用的RP - HPLC法，一般認為其具有檢測靈 敏度高、定量分析準確和柱效高等優點，且有多個標準方法基于該技術實施；但是該方法需 要高效液相色譜，且儀器預熱平衡和分析等過程時間較長，速度較慢，靈活性較差。生物傳 感器由于其具有在線監測的能力被推崇，但是現有技術仍不是非常成熟，市場較少有可靠 的成套裝備，且價格較昂貴。
[0005] 薄層色譜是一種無需昂貴的分析儀器，費用低，操作簡便、快捷，檢測限能夠達到 ng級別的方法。現已有效地應用于臨床和生化檢驗、毒物分析、藥材及其制劑真偽的鑒定、 質量控制、含量測定和資源調查等方面。但是薄層色譜需先對樣品進行衍生再進行薄層層 析檢測，其中對樣品的衍生化處理最為關鍵，一般需要考慮到衍生劑的選擇、衍生劑與樣品 液的體積比、衍生反應的時間和溫度。
[0006] 因此在食品加工和流通等環節迫切需要一種無需對樣品進行衍生處理，將樣品點 在薄層層析板就能夠檢測的一步薄層層析檢測生物胺的方法，從而滿足現場快速檢測的需 要，切實保障食品安全。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是克服上述現有技術中的缺點，提供一種一步薄層層析快速檢測生 物胺的方法，本發明設計巧妙、易操作、成本低、速度快、適于大規模應用。
[0008] 本發明的第一個目的是提供一種快速檢測生物胺的方法，所述方法包括：（1)活 化硅膠的制備：對硅膠進行環氧基、氨基、醛基的活化，使硅膠依次接上環氧基、氨基和醛 基；⑵活化薄層層析板的制備：活化好的硅膠介質分別進行調衆，鋪板和層析板活化制得 活化薄層層析板；（3)待測樣品中生物胺的薄層層析分析：從待測樣品中進行生物胺提取、 生物胺提取液凈化得到的生物胺凈化液，點在活化的薄層層析板上，展開，檢測目標生物胺 的有無或者定量測定生物胺的含量。
[0009] 所述步驟（1)，在本發明的一種實施方式中，是使用環氧氯丙烷、雙環氧乙烷、苯氧 基環氧丙烷、二一（環氧丙基）一鄰苯并咪唑酮中的任意一種對硅膠進行環氧基活化。 [0010] 所述環氧基活化，在本發明的一種實施方式中，環氧基的活化條件：以體積比 1:0. 5-1:2的0. 4-1. 2mol/LNaOH溶液與DMSO的混合液作為混合溶劑，震蕩，活化溫度為 30-40°C，活化時間8-14h，環氧氯丙烷、雙環氧乙烷、苯氧基環氧丙烷或二一（環氧丙基）一 鄰苯并咪唑酮的用量為2-10mL/g硅膠。
[0011] 所述環氧基活化，在本發明的一種實施方式中，以環氧氯丙烷作為環氧基活化 液，NaOH溶液濃度為0. 8-1. Omol/L，NaOH溶液與DMSO體積比為1:1-1:1. 5,活化溫度為 33-36°C，活化時間為10_12h，環氧氯丙烷的用量為4-7mL/g硅膠。
[0012] 所述步驟（1)，在本發明的一種實施方式中，是使用氨水、氯胺、乙二胺、雙氯胺中 的任意一種對硅膠進行氨基活化。
[0013] 所述氨基活化，在本發明的一種實施方式中，氨基的活化條件：以質量分數為 5% -15%的氨水、氯胺、乙二胺或雙氯胺作為活化液系，震蕩，活化溫度為32-38 °C，活化時 間8-14h，5% -15%的氨水、氯胺、乙二胺或雙氯胺的用量為15-30ml/g硅膠。
[0014] 所述氨基活化，在本發明的一種實施方式中，以氨水作為氨基活化液，氨水濃度為 8% -12%，活化溫度為34-36°C，活化時間為10_12h，8% -12%的氨水的用量為18-24ml/g 硅膠。
[0015] 所述步驟（1)，在本發明的一種實施方式中，是使用鄰苯二甲醛、戊二醛、乙二醛、 己二醛中的任意一種對硅膠進行醛基活化。
[0016] 所述醛基活化，在本發明的一種實施方式中，醛基的活化條件：以6_12g/L的鄰 苯二甲醛、戊二醛、乙二醛或己二醛作為活化液系，震蕩，活化溫度為26-32°C，活化時間 15-45min，6-12g/L的鄰苯二甲醛、戊二醛、乙二醛或己二醛的用量為5-12ml/g硅膠。
[0017] 所述醛基活化，在本發明的一種實施方式中，以鄰苯二甲醛作為醛基活化液，鄰苯 二甲醛濃度為8-10g/L，活化溫度為30°C，活化時間為30min，8-10g/L鄰苯二甲醛的用量為 6_8ml/g 娃膠。
[0018] 所述硅膠，在本發明的一種實施方式中，是采用100-200目國產硅膠或采用 200-300目德國默克公司進口硅膠。
[0019] 所述步驟（2)中的調漿，在本發明的一種實施方式中，是每取活化硅膠6_14g，加 入2. 2-2. 8g無水硫酸鈣，加入6-12ml去離子水，使固液1:0. 5-1:1. 5混合調成勻漿；
[0020] 所述調漿，在本發明的一種實施方式中，是稱取活化硅膠量為的10-12g，加入的無 水硫酸鈣為2. 4-2. 6g，加入的去離子水為8-10mL，固液比為1:0. 8-1:1. 2。
[0021] 所述步驟（2)中的鋪板，在本發明的一種實施方式中，是將勻漿均勻傾倒在層析 板上，然后真空干燥。
[0022] 所述鋪板，在本發明的一種實施方式中，基本步驟：將勻漿均勻傾倒在層析板上， 采用傾注法或用薄層涂鋪器手工鋪板，將鋪好的板放入真空干燥器中，真空干燥l_2h，表面 水分完全蒸發后用小刀和直尺將邊緣部分刮去。
[0023] 所述鋪板，在本發明的一種實施方式中，層析板為玻璃層析板、氧化鋁層析板或塑 料板，涂板方法采用薄層涂鋪器進行手工鋪板，真空干燥時間為I. 4-1. 6h。
[0024] 所述步驟（2)中的層析板活化，在本發明的一種實施方式中，是將鋪板后的薄層 層析板放入充滿保護氣體的裝置中進行層析板活化，活化后迅速放入裝有變性硅膠干燥劑 的裝置中備用。使用保護氣體能夠保護薄層層析板上的醛基不被氧氣氧化，從而能夠與生 物胺的氨基發生席夫堿反應而結合。變色硅膠的目的是為了吸去薄層層析板中的水分。
[0025] 所述保護氣體可以是以下任意一種：氮氣、氦氣、氙氣、氬氣、氪氣。
[0026] 在本發明的一種實施方式中，活化硅膠的干燥及薄層層析板的活化在保護氣體的 保護下完成，可以有效防止硅膠上連接的醛基被氧化，保證薄層層析板的功效。
[0027] 所述層析板活化，在本發明的一種實施方式中，基本步驟：將鋪好的薄層層析板放 入充滿保護氣體的塑料盒，然后將塑料盒放入l〇5°C烘箱活化30-45min，活化完成后迅速 放入裝有變性硅膠干燥劑的塑料箱中備用；
[0028] 所述層析板活化，在本發明的一種實施方式中，活化時間為35_40min ;
[0029] 所述步驟（2)，在本發明的一種實施方式中，在調漿前需要對活化的硅膠進行干燥 處理。所述干燥處理，在本發明的一種實施方式中，是將活化硅膠置于充滿氮氣或氦氣的塑 料盒然后于36-38?烘箱中干燥；調漿步驟中無水硫酸鈣含量為12-15%。
[0030] 所述步驟（3)中的生物胺凈化液，在本發明的一種實施方式中，按以下方法制備： 將食品樣品，用水、酸性介質或有機相介質提取樣品中生物胺，然后用三氯乙酸稀釋，獲得 生物胺提取液；將生物胺提取液與正己烷混合、萃取脫去脂肪，然后進行液一液萃取，氮氣 吹干并加入鹽酸溶解殘留物，獲得生物胺凈化液。
[0031] 所述步驟（3)中生物胺的檢測，在本發明的一種實施方式中，是：采用碘蒸汽或噴 霧顯色或者不顯色，然后于360nm紫外條件下對色譜板進行觀察以確定樣品中是否存在目 標生物胺，或者是采用薄層掃描儀在參比波長360nm，樣品波長254nm條件下對色譜板進行 掃描，根據每個斑點的吸光值進行定量計算。
[0032] 所述薄層掃描儀，在本發明的一種實施方式中是島津雙波長飛點薄層掃描儀 CS-93