一種原位合成的納米金比色法檢測脂肪酶酶活的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析化學領域，具體涉及一種原位合成的納米金作為信號元件，吐溫既作為脂肪酶的底物又作為原位合成的納米金的保護劑的檢測脂肪酶酶活的化學比色法。
【背景技術】
[0002]脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)是一種長鏈三酰基甘油酯水解酶，只能在異相或有機相中作用，其主要催化酯化、水解、氨解和酯交換等反應，已經被廣泛應用于食品、洗滌齊U、皮革、紡織品、化妝品、造紙與制藥等諸多工業領域。隨著脂肪酶應用領域不斷拓寬，因而建立一種成本低、操作簡單、方便快捷的檢測脂肪酶酶活的方法顯得尤為重要。
[0003]眾所周知，檢測脂肪酶活性的方法很多，如滴定法、光譜法、色譜法、放射法、界面張力測量法、濁度法、電導法和免疫化學法等，其中最為常用的是滴定法和光譜法。滴定法是通過定量從三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯和橄欖油中釋放出的游離脂肪酸的一種檢測脂肪酶活性的方法。在光譜法中，檢測脂肪酶活性主要使用的底物是對硝基苯基棕櫚酸酯(P-NPP)，利用它水解的有色產物-對硝基苯酚在410nm處進行光譜檢測，從而間接定量脂肪酶活性。這兩種方法所使用的底物都需要乳化，乳化劑的加入會影響酶活的測定，且都受到PH范圍的限制。另外，利用p-NPP的光譜法雖然操作簡單快速，但是p-NPP試劑昂貴且靈敏度不高，所以此法不能廣泛地作為檢測脂肪酶標準的試驗方法。
[0004]目前，基于原位構建納米探針用于目標物的檢測越來越受到關注。CarlosBendicho等人利用原位合成的碳量子點來檢測甲基萊，Mehmet Bayindir等人基于原位形成的聚多巴胺納米顆粒來傳感多巴胺，Apurba K.Das等人采用原位合成的納米金來定量堿性磷酸酶等等。這種方法同時實現了納米探針的構建和目標物的傳感，簡化了操作步驟，并且具有較好的選擇性和靈敏度。
[0005]現有技術未公開基于原位合成的納米金比色法檢測脂肪酶酶活的技術方案。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種基于原位合成的納米金用于檢測脂肪酶的簡單、廉價、有效和可視化的分析法。此方法利用吐溫自氧化產生過氧化氫的特點，將氯金酸還原成納米金作為顯色信號元件，同時吐溫既作為脂肪酶的底物又作為原位合成的納米金的保護劑。
[0007]本發明在解決上述技術問題所采用的技術方案如下:
[0008]一種原位合成的納米金比色法檢測脂肪酶酶活，具體包括如下步驟:
[0009](I)分別向2mL A、B離心管中加入吐溫溶液；
[0010](2)向步驟(I)中得到的A、B離心管溶液分別加入緩沖溶液進行pH的調節；后向B離心管加入待測脂肪酶溶液，A離心管不需要加入待測脂肪酶溶液；混勻，調節反應溫度；可通過調節待測脂肪酶溶液反應的時間，得到一定時間后檢測溶液的紫外可見光譜，以Λ A530為縱坐標，時間為橫坐標，繪制脂肪酶酶活的動力學曲線；
[0011](3)向步驟(2)中得到的A、B離心管溶液加入氯金酸溶液，混勻，調節反應溫度和時間；在A離心管中，不存在待測脂肪酶溶液，吐溫溶液仍然保持它的原始膠束結構，所以吐溫溶液的自氧化發生在膠束相內，在B離心管中，存在待測脂肪酶溶液，吐溫溶液的膠束結構遭到破壞，吐溫溶液依然可以發生自氧化，但是這一過程發生在膠束相外，其反應速率和機理存在不同，因此，當加入氯金酸溶液時，會形成不同顏色的納米金溶液，然后進行紫外檢測，以吸光度作為縱坐標，波長為橫坐標，繪制紫外吸收曲線。
[0012]本發明所述的方法，所述步驟(I)中加入吐溫溶液的最終濃度為0.1% -3% (V/V)，優選吐溫溶液的最終濃度為I %。
[0013]其中，所述步驟(2)中的緩沖溶液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，該緩沖液的濃度及具體用量為本領域技術人員所理解和掌握，具體以最終形成納米金溶液PH值調至6-9為準，優選8.5。
[0014]其中，所述步驟⑵中待測脂肪酶溶液反應溫度為30_60°C，優選45°C ;待測脂肪酶溶液的加入量為0.25-4mg/mL，優選2mg/mL。
[0015]其中，所述步驟(3)中氯金酸溶液的最終濃度為0.1-2.0mmol/L,優選1.5mmol/L ；吐溫溶液和氯金酸溶液反應溫度為10_40°C，優選25°C ；吐溫溶液和氯金酸溶液反應時間為10_300min,優選 210min。
[0016]更具體地，本發明所述的一種原位合成的納米金比色法檢測脂肪酶酶活，包括如下步驟:
[0017](I)分別向2mL A、B離心管中加入吐溫溶液的最終濃度為0.1% -3% (V/V)；
[0018](2)向步驟(I)中得到的A、B離心管溶液分別加入緩沖溶液進行pH的調節，將PH值調至6-9 ;后向B離心管加入待測脂肪酶溶液，A離心管不需要加入待測脂肪酶溶液；混勻，調節反應溫度至30-60°C ;可通過調節待測脂肪酶溶液反應的時間，得到一定時間后檢測溶液的紫外可見光譜，以Λ A530為縱坐標，時間為橫坐標，繪制脂肪酶酶活的動力學曲線.
[0019](3)向步驟⑵中得到的Α、B離心管溶液加入氯金酸溶液的最終濃度為0.1-2.0mmol/L，混勻，調節反應溫度為10_40°C和時間為10_300min ;在八離心管中，不存在待測脂肪酶溶液，吐溫溶液仍然保持它的原始膠束結構，所以吐溫溶液的自氧化發生在膠束相內，在B離心管中，存在待測脂肪酶溶液，吐溫溶液的膠束結構遭到破壞，吐溫溶液依然可以發生自氧化，但是這一過程發生在膠束相外，其反應速率和機理存在不同，因此，當加入氯金酸溶液時，會形成不同顏色的納米金溶液，然后進行紫外檢測，以吸光度作為縱坐標，波長為橫坐標，繪制紫外吸收曲線。
[0020]本發明采用吐溫自氧化產生過氧化氫的特點，將氯金酸還原成納米金作為顯色信號元件，同時吐溫既作為脂肪酶的底物又作為原位合成的納米金的保護劑。在不存在待測脂肪酶溶液，吐溫溶液仍然保持它的原始膠束結構，所以吐溫溶液的自氧化發生在膠束相內；在存在待測脂肪酶溶液，吐溫溶液的膠束結構遭到破壞，吐溫溶液依然可以發生自氧化，但是這一過程發生在膠束相外，其反應速率和機理存在不同，當加入氯金酸溶液時，會形成不同顏色的納米金溶液，然后進行紫外檢測，兩者吸光度的差值AA53tl的變化與脂肪酶酶活有關，因此能夠用于檢測脂肪酶酶活。
[0021]本發明所述的技術方案所采用的吐溫，由于它的溶解性能好，作為脂肪酶的底物就無需加入乳化劑進行乳化，同時又作為原位合成納米金的還原劑和保護劑，更加充分地簡化了操作步驟，實現了納米探針構建和目標物傳感的一步化。此外，本發明基于納米金比色法傳感，可視化適用于高通量檢測，原位合成的納米金比較穩定，受到外界因素的干擾小，可用于實際體系中脂肪酶的檢測，適宜推廣應用。
【附圖說明】
[0022]圖1為(a)吐溫(1% )還原氯金酸(1.5mmol/L)形成納米金溶液(無脂肪酶)；(b)吐溫(1% )還原氯金酸(1.5mmol/L)形成納米金溶液(有2mg/mL失活脂肪酶)；(c)吐溫(1% )還原氯金酸(L 5mmol/L)形成納米金溶液(有2mg/mL脂肪酶)的紫外可見光
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[0023]圖2 為分別為加入脂肪酶(a) Omin ； (b) Imin ； (c) 2min ； (d) 3min ； (e) 4min ；(f) 5min ； (g) 1min ； (h) 15min ； (i) 20min ； (j) 25min ； (k) 30min 后，吐溫(I % )還原氯金酸(1.5mmol/L)形成的納米金溶液的紫外可見光譜。
[0024]圖3為脂肪酶酶活的動力學曲線。
【具體實施方式】
[0025]實施例1
[0026](I)分別向2mL A、B離心管中加入吐溫溶液的最終濃度為1% (V/V)；
[0027](2)向步驟⑴中得到的A、B離心管溶液分別加入緩沖溶液進行pH的調節，將pH值調至8.5 ;后向B離心管加入待測脂肪酶溶液，A離心管不需要加入待測脂肪酶溶液；混勻，調節反應溫度至45°C ;可通過調節待測脂肪酶溶液反應的時間，得到一定時間后檢測溶液的紫外可見光譜(見圖2)，以AA53tlS縱坐標，時間為橫坐標，繪制脂肪酶酶活的動力學曲線(見圖3);
[0028](3)向步驟(2)中得到的A、B離心管溶液加入氯金酸溶液的最終濃度為1.5mmol/L，混勻，調節反應溫度為25°C和時間為210min ;在A離心管中，不存在待測脂肪酶溶液，吐溫溶液仍然保持它的原始膠束結構，所以吐溫溶液的自氧化發生在膠束相內，在B離心管中，存在待測脂