一種ELISA檢測人血清HCMV pp150 IgM抗體試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬基因工程技術、診斷試劑領域，尤其設及一種化ISA檢測人血清HCMV ppl50 IgM抗體試劑盒。
【背景技術】
[0002] 人巨細胞病毒（Human切tomegalovirus，HCMV)屬于人類瘤疹病毒0亞科病毒， 在人群中的感染極為普遍，呈世界性分布，血清流行病學調查表明，40-100 %成人有HCMV 抗體。目前的研究表明HCMV是人類先天性感染最常見的病原體之一，對孕婦及胎兒影響巨 大，孕期的HCMV原發感染危害尤為巨大，2/3先天性感染是由孕期原發感染造成的。先天性 感染中90%的患兒不表現臨床癥狀，5% -10%可造成流產、死胎、胎兒崎形、發育遲緩及遲 發性中樞神經系統缺陷等疾病。此外，HCMV感染也是器官移植失敗和艾滋病病人并發感染 死亡的主要原因之一。
[0003] 快速準確的診斷和監測HCMV感染狀態的方法在臨床上是急需的，在一些特定的 人群中尤為重要，比如器官移植手術中的供體和受體，育齡婦女W及接受免疫抑制劑治療 的人群等。HCMV在免疫力正常人群中通常呈現無癥狀感染，病毒復制受到抑制，有間歇性 排毒現象存在。而在HCMV活動性感染中，病毒大量復制，可在血液，尿液，腦脊液等檢測到 活病毒。病毒分離是診斷HCMV活動性感染最重要的指標之一。但是由于病毒自身的復制 特點，病毒分離實驗周期較長。而且病毒分離實驗本身操作繁瑣，對實驗條件，設備有一定 的要求，不適用于臨床對該病毒的及時監測及診斷。血清中HCMV特異的IgM抗體是診斷新 近感染的重要指標，IgM抗體在機體病毒原發感染3-5天即可出現，持續12-16周時間。采 用ELISA試劑盒檢測HCMV特異的IgM抗體，檢測方法簡單，實驗周期短，可重復性高，適用 于臨床診斷。
[0004] 捕獲法用于檢測血清中HCMV特異的IgM抗體原理是，采用抗人IgM y鏈特異性 單克隆抗體包被酶標反應板，能與血清中的IgM抗體特異性結合。再加入辣根過氧化物酶 (HRF0標記的抗原，加入底物反應一定的時間并終止反應。在一定的范圍內，吸光度值（0D) 的大小體現血清樣品中IgM抗體的含量多少。相對于間接法，捕獲法不受血清中高滴度的 IgG抗體影響，特異性更好。
[0005] HCMV PP150是瘤疹病毒0亞科特有基因，在HCMV眾多結構蛋白質中PP150是免 疫原性最強的，是刺激機體產生體液免疫的主要祀抗原，也是殺傷性T淋己細胞（CTL)主 要識別抗原。在病毒感染的恢復期，血清中針對PP150的抗體存在時間較針對其他抗原的 抗體存在時間長。HCMV PP150還是能夠刺激機體產生IgM為數不多的CMV抗原之一。因 此采用該蛋白作為捕獲法酶標抗原不僅可W保證檢測方法的可靠性還可W減少瘤疹病毒 之間的交叉反應，從而提高檢測方法的特異性。通過缺失突變株的構建證實PP150對病毒 在細胞質中的包裝成熟至關重要，PP150缺失突變株基因復制能夠正常進行，但是病毒不 能完成最終的包裝，也不能夠感染鄰近的細胞。完整的PP150由1048個氨基酸組成，含有 多個抗原表位。但是通過截短表達或者單獨表達該些抗原表位發現，他們并不是都能夠和 CMV陽性血清反應。已有的研究還表明，單純的串聯表達同一抗原表位不能夠增強該抗原 的免疫原性和免疫反應性，而將不同的抗原表位串聯表達可W很好的增強其免疫原性和免 疫反應性。鑒于此，我們采用融合PCR的方法，將HCMVPP150的兩個優勢抗原表位（膚段 aa495-691，aa862-1048)的編碼區域直接連接起來插入祀T32(b)表達載體，導入大腸埃希 氏菌化2UDE3)。經誘導表達獲得截短PP150蛋白。用該蛋白作為捕獲法檢測IgM抗體的 ELISA試劑盒的酶標抗原，包裝的試劑盒與德國DiaSorin公司的HCMV IgM檢測試劑盒W及 國內某公司的HCMV IgM試劑盒比較。W德國DiaSorin公司的HCMV全病毒包裝IgM檢測試 劑盒做為標準，結果顯示；本項目發明試劑盒特異性為100 %，敏感性為95. 6 %，均優于國 內某公司的HCMV IgM試劑盒（分別為95. 7%和86. 9% )。敏感性雖略低于德國DiaSorin 公司的HCMV全病毒包裝IgM檢測試劑盒（100% )，但是特異性高于德國DiaSorin公司的 HCMV全病毒包裝IgM檢測試劑盒巧8. 9% )。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是現有臨床檢測技術的不足，提供一種通過化ISA方法快速檢測樣 品中HCMV I gM抗體的試劑盒。
[0007] 為了實現上述目的本發明采用如下技術方案：
[000引一種ELISA檢測人血清肥MV PP150 IgM抗體試劑盒，其特征在于；使用的酶標抗 原是辣根過氧化物酶標記的重組蛋白HCMV PP150。
[0009] 所述的一種化ISA檢測人血清肥MV ppl50 IgM抗體試劑盒，其特征在于；所述的 辣根過氧化物酶標記的重組蛋白HCMV PP150的制備方法為：
[0010] A、HCMV PP150重組蛋白獲取
[0011] (1)根據Genebank中已公布的HCMV基因序列，確定HCMV PP150基因編碼序列，設 計用于擴增aa495-691和aa862-1048的融合PCR引物，W肥MV AD169株DNA為模板，擴增 出的目的片段大小為115化P，將其克隆到祀T3化載體上，構建重組質粒祀T3化/ppl50,在 通過DNA測序獲得肥MV PP150基因核酸序列正確的重組載體，轉化大腸桿菌化21 0E3)， 經IPTG誘導后，菌體蛋白經SDS - PAGE蛋白電泳及Western blotting鑒定；
[0012] (2)將表達HCMV PP150重組蛋白的大腸桿菌經過大量培養至對數期，加IPTG誘導 5小時，離屯、收集菌體，破碎后120(K)巧m超速離屯、30min收集上清，親和層析純化后得到大 量HCMV PP150重組蛋白；
[0013] B、辣根過氧化物酶標記抗原重組蛋白HCMVppl50
[0014] (1)稱取 4. 8-5. 2mgHRP 溶解于 0. 8-1. 2ml 蒸饋水中；
[0015] (2)于步驟（1)所得溶液中加入0. 15-0. 25ml新配的0. 05-0. 15M的化1〇4溶液， 室溫下避光攬拌15-25分鐘；
[0016] (3)將步驟（2)所得溶液溶液裝入透析袋中，對0. 5-1. 5mM PH4. 3-4. 5的醋酸鋼緩 沖液透析，3-5°C下放置6-8小時，得醒化HRP ;
[0017] (4)加20 y 1 0. 2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使W上醒化HRP的PH升高到9. 0-9. 5， 然后立即加入lOmg純化后的HCMV PP150重組蛋白在1ml 0. 01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避 光輕輕攬拌2小時；
[001引 妨加0. 1ml新配的4mg/ml化肌4液，混勻，再于4°C下放置2小時；
[0019] 做將上述溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4 PBS透析，4°C過夜；
[0020] (7)在攬拌下逐滴加入等體積飽和硫酸錠，4°C下放置1小時；
[0021] (8) 3000rpm離屯、半小時，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸錠洗二次，最后沉淀物溶于 5ml 0. 15M PH7. 4 的 PBS 中；
[0022] (9)將上述溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PBS緩沖鹽水透析，去除錠離 子后，10000巧m離屯、30分鐘去除沉淀，上清液即為辣根過氧化物酶標記抗原重組蛋白 HCMV卵150,分裝后，-20°C左右保存。
[002引所述的一種化ISA檢測人血清肥MV PP150 IgM抗體試劑盒，其特征在于；本試劑 盒由抗人IgM y鏈抗體包被酶標反應板、標本稀釋液、洗漆液、酶標抗原、顯色液、終止液、 陽性對照、陰性對照構成。
[0024] 所述的一種化ISA檢測人血清肥MV ppl50 IgM抗體試劑盒，其特征在于；所述的 陽性對照是臨床確診為HCMV IgM陽性的血清；陰性對照是臨床確診為HCMV IgM陰性的血 清；標本稀釋液指的是含10%小牛血清和血漿顯色劑的0. 01M pH7. 4的磯酸鹽緩沖液；洗 漆液指的是含有0. 05% Tween 20的磯酸鹽緩沖液；酶標抗原為辣根過氧化物酶標記的重 組蛋白HCMV PP150 ;顯色液為TMB-H2O2尿素溶液；終止液為2mol/L H2SO4溶液。
[0025] 所述的一種化ISA檢測人血清HCMV PP150 IgM抗體試劑盒，其特