一種羅非魚源無乳鏈球菌elisa快速檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種無乳鏈球菌早期快速檢測技術，尤其是一種羅非魚源無乳鏈球菌 ELISA快速檢測試劑盒及其檢測方法，屬于檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 無乳鏈球菌（Streptococ州S agalactiae)又名 B 族鏈球菌（Group B Streptococcus,GB巧，革蘭氏陽性球菌，是自然界中廣泛存在的一種條件致病菌。羅非魚是 我國出口量最大的養殖魚類，曾經W易養抗病力強著稱，但2009年在我國海南省首次大規 模爆發無乳鏈球菌病后，已成為危害我國羅非魚產業最嚴重的病原菌。從生產角度，該病面 臨表現癥狀復雜化，發病快，死亡率高等特點，給防治技術的研究和應用帶來了困難，也是 目前尚無有效手段控制的癥結之一。因此，建立簡便，穩定的無乳鏈球菌快速檢測技術，尤 其是早期快速檢測技術就顯得尤為重要和迫切。PCR檢測方法（雙重PCR，H重PCR，巢式 PCR)靈敏度高，但受實驗條件、費用高、假陽性率高點等因素的限制，不宜推廣。相比之下 ELISA方法操作簡單易行，無需特殊儀器，更適合基層單位進行羅非魚無乳鏈球菌病原菌的 篩查。郭玉娟（2012年）和霍歡歡（2013年）的研究表明，我國羅非魚源無乳鏈球菌的分 子血清型均為la型，說明不同年份和不同地區的羅非魚源無乳鏈球菌在血清型上未發生 明顯的變異，為無乳鏈球菌化ISA快速檢測試劑盒的研制和臨床適用提供了基礎保障。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是克服現有技術中存在的不足，提供一種羅非魚源無乳鏈球菌 ELISA快速檢測試劑盒及其檢測方法，能實現對羅非魚源無乳鏈球菌高通量快速檢測。
[0004] 按照本發明提供的技術方案，一種羅非魚源無乳鏈球菌化ISA快速檢測試劑盒， 包括酶標板，包被緩沖液、BSA封閉液、PBST洗涂緩沖液、一抗陽性血清、陰性對照血清、稀 釋液、酶標二抗、底物顯色液和終止液；
[0005] 包被抗原為用包被緩沖液稀釋的濃度為106?10 8c化/mL的病原菌液；
[0006] 所述快速檢測試劑盒的檢測方法是將W經分離并培養得到的病原菌液為作為包 被抗原；陽性判斷標準如下；（被檢樣品〇〇4。。值一空白對照0D 45。值）/ (陰性對照樣品0D 4W 值一空白對照〇〇4日。值）> 2. 1。
[0007] 所述包被緩沖液為0. 05M碳酸鹽緩沖液，pH為9. 6 ;其組份為Na2C〇3 1. 59g， NaHCOgS. 93g,無菌水定容至1000mL，4°C保存不超過1周。
[0008] 所述PBST洗涂緩沖液為含吐溫-20的0. 15M PBS，其組份為：化C1 8. Og ; 化2冊〇4. 12&0 2. 9g ;KC1 0. 2g ;皿2口〇4 0. 24g ;吐溫-200. 5mL 化0 lOOOmL。
[0009] 所述的BSA封閉液為0.25%?1 %的牛血清蛋白溶液，其組份為；0.25g?Ig的 牛血清蛋白、100血的PBST洗涂緩沖液。
[0010] 所述的一抗陽性血清是W羅非魚源無乳鏈球菌LB110808-2為抗原，免疫兔子獲 得效價達1:2560 W上的多克隆抗體；未進行免疫的兔血清作為陰性對照血清。
[0011] 所述的酶標二抗為羊抗兔IgG-HRP酶標抗體。
[001引所述的稀釋液為0. 1 %的牛血清蛋白溶液，其組份為0. Ig的牛血清蛋白、100血的 PBST洗涂緩沖液。
[0013] 所述的底物顯色液為可溶型單組分TMB (即四甲基聯苯胺）底物溶液，其組分為 TMB (2mg/mL無水己醇）0. 5血，底物緩沖液10血，0. 75 % &化32. 0 y L ;所述的底物緩沖液配 制方法為0. 2M化2冊〇4 25. 7血，0. 1M巧樣酸24. 3血，d地2〇定容至50血。
[0014] 所述的終止液為2M H2SO4。
[001引所述羅非魚源無乳鏈球菌化ISA快速檢測試劑盒的檢測方法，步驟為：
[0016] (1)抗原包被：用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋病原菌，每種病原菌分別設陰性對照 孔和空白對照孔，每個被檢樣品孔和陰性對照孔內分別加入50?150 y L的1〇6?10 8 C化/ 血濃度的病原菌，空白對照孔加入50?150 y L的包被緩沖液，6(TC烘箱內4?12小時烘 干；
[0017] 似洗板海個酶標板孔內加入200?300 y L PBST洗涂緩沖液，靜置1?5分鐘， 甩去洗液，在吸水紙上盡量拍干，重復3?5次；
[001引 （3)封閉；每個酶標板孔內加入100?300y L 0. 25%?1%的BSA封閉液，封閉 60?120分鐘；空白對照孔不加任何試劑；
[0019] (4)洗板；每個酶標板孔內加入200?300 y Ly L PBST洗涂液，靜置1?5分鐘， 甩去洗液，在吸水紙上盡量拍干，重復3?5次；
[0020] (5)加一抗陽性血清；一抗陽性血清用稀釋液稀釋5000?30000倍后，每孔 100 y L，37°C賠育60?90min ;被檢樣品孔加一抗陽性血清，陰性對照孔加陰性對照血清， 空白對照孔不加任何試劑；
[0021] (6)洗板；每個酶標板孔內加入200?300 y L PBST洗涂液，靜置1?5分鐘，甩 去洗液，在吸水紙上盡量拍干，重復3?5次；
[002引 （7)加酶標二抗；每孔加入工作濃度1000?2000倍稀釋的50?150 y L的羊抗 兔IgG-HRP酶標抗體，37°C賠育60?90min ;
[0023] (8)洗板；每個酶標板孔內加入200?300 y L PBST洗涂液，靜置1?5分鐘，甩 去洗液，在吸水紙上盡量拍干，重復3?5次；
[0024] (9)加底物：每孔加入可溶型單組分TMB底物溶液50?150iiL，37°C避光反應 15 ?20min ;
[002引 （10)終止反應海孔加入終止液50 y L ;
[002引 （11)讀數；在酶標儀450皿下讀數；
[0027] (。）結果的判斷：
[0028] a、肉眼觀察：與陰性對照孔進行比較，若被檢樣品孔中現黃色，則被檢樣品孔為陽 性；若被檢樣品孔與陰性對照孔一樣為無色，則被檢樣品孔為陰性；
[0029] b、酶標儀檢測；（被檢樣品0〇45。值一空白對照0D 45。值）/ (陰性對照樣品0D 45。值一 空白對照〇〇45。值）> 2. 1，被檢樣品孔為陽性，反之則為陰性。
[0030] 本發明的有益效果；本發明所建立的檢測方法具有特異性好、靈敏度高、重復性 好及方便快捷和使用范圍廣的優點。本發明可在96孔酶標板中進行，樣品檢測成本遠低于 傳統的儀器檢測方法，適用于基層單位對羅非魚源無乳鏈球菌的臨床大規模檢測和流行病 學調查。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合實施例對本發明作進一步說明。
[0032] 實施例1 一種羅非魚源無乳鏈球菌ELISA快速檢巧IJ試劑盒
[0033] 所述的試劑盒包含酶標板，包被緩沖液、封閉液、PBST洗涂緩沖液、一抗陽性血清、 陰性對照血清、稀釋液、酶標二抗、底物顯色液和終止液，其中，所用的包被抗原為用包被緩 沖液稀釋的濃度為l〇 6c化/mL的病原菌液。
[0034] 該間接化ISA方法是將W經分離并培養得到的病原菌液為作為包被抗原；而且陽 性判斷標準如下：（被檢樣品〇〇45。值一空白對照〇〇45。值）/(陰性對照樣品〇〇45。值一空白 對照〇〇4日0值）> 2. 1。
[0035] 所述包被緩沖液為0. 05M碳酸鹽緩沖液，pH為9. 6,其組份為NasCOjl. 59g， NaHOy. 93g，無菌水定容至1000mL，4°C保存不超過1周。
[0036] 所述PBST洗涂緩沖液為含吐溫20的0. 15M PBS，其組份為；NaCl 8. Og ; 化2冊〇4. 12&0 2. 9g ;KC1 0. 2g ;皿2口〇4 0. 24g ;吐溫-20 0. 5血化0 1000血。
[0037] 所述的封閉液為0. 25%?1 %的牛血清蛋白溶液，其組份為；0. 25g?Ig的牛血 清蛋白、100血的PBST洗涂緩沖液。
[0038] 所述的一抗血清是W羅非魚源無乳鏈球菌LB110808-2為抗原，免疫兔子獲得效 價達1:2560 W上的多克隆抗體；未進行免疫的兔血清作為陰性對照血清。
[0039] 所述的酶標二抗為羊抗兔IgG-HRP酶標抗體。
[0040] 所述的稀釋液為0. 1%的牛血清蛋白溶液，其組份為；0. Ig的牛血清蛋白、100血 的PBST洗涂緩沖液。
[0041] 所述的底物顯色液為可溶型單組分TMB(即四甲基聯苯胺）底物溶液，其組分為 TMB (2mg/血無水己醇）0. 5血，底物緩沖液10血，0. 75 % &化32. 0 y L ;所述的底物緩沖液配 制方法為0. 2M化2冊〇4 25. 7血，0. 1M巧樣酸24. 3血，d地2〇定容至50血。
[0042] 所述的終止液為2M恥〇4。
[0043] 所述的試劑盒采用從羅非魚上分離并培養得到的病原菌作為分析樣品，其特征 是，包括W下步驟：
[0044] (1)抗原包被：用PH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋病原菌，每種病原菌分別設陰性對照 孔和空白對照孔，每個被檢樣品孔和陰性對照孔內分別加入lOOy L的l〇6c化/mL濃度的病 原菌，空白對照孔加入100 y L的包被緩