一種用于檢測黃曲霉毒素b1的方法及酶聯免疫試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種用于檢測黃曲霉毒素B1的方法及酶聯免疫試劑盒。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素是曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉的二次代謝產物。該些霉菌來源于潮 濕的熱帶地區，大面積種植的糧食作物會被其污染。黃曲霉毒素是自然界最危險的致癌物 質。
[0003] 黃曲霉毒素中毒性最強的是黃曲霉毒素B1，其幾乎一直和黃曲霉毒素B2、G1和G2 共存。他們主要存在于玉米、花生、堅果、棉巧等食物中。美國食品和藥品監督管理局（抑A) 已對食品和飼料中的黃曲霉毒素最高允許水平作了規定，因此，準確測定黃曲霉毒素含量 對于食品和飼料的品質監控具有重要意義。
[0004] 目前，黃曲霉毒素B1國家標準所采取的方法是薄層分析、分光光度計法W及高效 液相分析法。該些方法雖能達到國家標準檢測要求，但檢測花費比較昂貴，且不能大批量快 速的檢測，不能滿足市場上實地檢測的要求。近年來，我國科研工作者在黃曲霉毒素B1檢 測方面做了大量的工作，但都主要集中在理化檢測方面，文獻檢索尚未發現關于黃曲霉毒 素B1的化ISA檢測方法的報道，鑒于此，本發明研究和建立了黃曲霉毒素B1的直接競爭 EL ISA檢測方法，研制了檢測黃曲霉毒素B1的方法及酶聯免疫試劑盒。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為解決目前黃曲霉毒素B1檢測費用比較昂貴，且不能大批量快 速檢測，不能滿足實地檢測要求的技術問題。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種檢測樣品中黃曲霉毒素B1含量的方法， 包括W下步驟： 1) 用黃曲霉毒素B1特異性抗體包被酶標板； 2) 加入標準品或待測樣品W及酶標記的黃曲霉毒素B1半抗原，解育，洗漆； 3) 加入底物顯色液顯色； 4) 加入反應終止液終止反應； 5) 通過比較黃曲霉毒素B1標準品與待測樣品的顏色，推測出待測樣品中的黃曲霉毒 素B1含量；或者，測定各孔的吸光度，建立黃曲霉毒素B1濃度相對于吸光度的標準曲線，并 根據該標準曲線由待測樣品的吸光度推算出待測樣品中的黃曲霉毒素B1含量。
[0007] 本發明還提供另一種檢測樣品中黃曲霉毒素B1含量的方法，包括W下步驟： 1) 用黃曲霉毒素B1半抗原或黃曲霉毒素B1半抗原-載體蛋白偶聯物包被酶標板； 2) 加入黃曲霉毒素B1標準品或待測樣品； 3) 加入黃曲霉毒素B1特異性抗體，解育，洗漆； 4) 加入酶標記的抗體，解育，洗漆； 5) 加入底物顯色液顯色； 6) 加入反應終止液終止反應； 7) 通過比較黃曲霉毒素B1標準品與待測樣品的顏色，推測出待測樣品中的黃曲霉毒 素B1含量；或者，測定各孔的吸光度，建立黃曲霉毒素B1濃度相對于吸光度的標準曲線，并 根據該標準曲線由待測樣品的吸光度推算出待測樣品中的黃曲霉毒素B1含量。
[000引進一步地，在本發明所提供的檢測樣品中黃曲霉毒素B1含量的方法，還可W包括 樣品前處理步驟： 當所述樣品為谷物時，所述樣品前處理方法為；將樣品粉碎后與樣品稀釋液W質量體 積比1 : 5-10混合均勻，強力振蕩，離屯、后取上清液待測； 當所述樣品為非奶油蛋糕時，所述樣品前處理方法為；將樣品粉碎后與50%甲醇W質 量體積比為1 : 3-6混合均勻，強力振蕩，離屯、后取一定體積的下層液體，將下層液體與一 定體積的樣品稀釋液W體積比1 : 1-2混合均勻，取稀釋后液體待測； 當所述樣品為花生或奶油蛋糕時，所述樣品前處理方法為；將樣品粉碎后與石油離W 質量體積比為1 : 3-6混合均勻，強力振蕩，離屯、后取一定體積的下層液體，將下層液體與 一定體積的樣品稀釋液W體積比1 : 1-2混合均勻，取稀釋后液體待測； 當所述樣品為食用油時，所述樣品前處理方法為；將樣品與石油離W質量體積比為 1 : 3-6混合均勻，再加入與樣品質量體積比為3-6 : 1的50 %甲醇混合均勻，振蕩，靜置 后取一定體積的下層液體，將下層液體與一定體積的樣品稀釋液W體積比1 : 1-2混合均 勻，取稀釋后液體待測； 當所述樣品為飼料、面粉或湯圓時，所述樣品前處理方法為；將樣品粉碎后與80%甲 醇W質量體積比為1 : 2-5混合均勻，強力振蕩，離屯、后取一定體積的上層清液，將上層清 液與一定體積的樣品稀釋液W體積比1 : 5-10混合均勻，取稀釋后液體待測； 當所述樣品為啤酒時，所述樣品前處理方法為；將樣品去除氣體后與樣品稀釋液W體 積比1 : 5-10混合均勻，振蕩，取稀釋后液體待測； 當所述樣品為醬油、醋或葡萄酒時，所述樣品前處理方法為；將樣品與蒸饋水及=氯甲 燒W體積比為1 : 1:6-10混合均勻，振蕩，離屯、后取一定體積的下層液體，用60°C氮氣將 下層液體吹干成干燥物，加入與下層液體的體積比為0. 8-1:1的己膳溶解干燥物，再加入 與己膳的體積比為8-10:1的的樣品稀釋液混合均勻，取稀釋后液體待測。
[0009] 本發明還提供一種檢測黃曲霉毒素B1的酶聯免疫試劑盒，包括黃曲霉毒素B1半 抗原和黃曲霉毒素B1的特異性抗體；所述特異性抗體為黃曲霉毒素B1的多克隆抗體或單 克隆抗體。
[0010] 進一步地，所述黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白偶聯，得到的黃曲霉毒素B1半抗 原-載體蛋白偶聯物作為包被原，所述特異性抗體為酶標記的；所述特異性抗體作為包被 原，所述半抗原為酶標記的。
[0011] 進一步地，所述黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白偶聯，得到的黃曲霉毒素B1半抗 原-載體蛋白偶聯物作為包被原；所述半抗原為酶標記的。
[0012] 進一步地，還包括酶標板、黃曲霉毒素B1標準溶液、底物液、底物緩沖液、反應終 止液、濃縮洗漆液、樣品稀釋液中的至少一種。
[0013] 進一步地，所述濃縮洗漆液為抑值為7. 2-7. 6、含有終濃度為4. 0-6. 0% (質量） 的吐溫-20、0. 1-0. 2mol/L的磯酸鹽緩沖液，優選地，所述濃縮洗漆液為抑值為7. 4、含有 終濃度為5% (質量）的吐溫-20的0. Imol/L磯酸鹽緩沖液；所述反應終止液為l-2mol/ L的硫酸溶液或2mol/L的鹽酸溶液。
[0014] 進一步地，所述酶標記中所用的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磯酸酶； 當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物液為含有3, 3, 5, 5-四甲基聯苯胺或鄰苯二 胺的pH = 5. 0的磯酸-巧樣酸緩沖溶液，所述底物緩沖液為含有過氧化氨或過氧化脈的pH =5. 0的磯酸-巧樣酸緩沖溶液； 當標記酶為堿性磯酸醋酶時，所述底物液為對硝基磯酸鹽緩沖液，所述底物緩沖液為 含有過氧化氨或氧化脈的pH = 5. 0的磯酸-巧樣酸緩沖溶液。
[0015] 進一步地，所述黃曲霉毒素B1半抗原或黃曲霉毒素B1半抗原-載體蛋白偶聯物、 所述黃曲霉毒素B1的特異性抗體的任意一種已包被在酶標板上。
[0016] 本發明采用直接競爭化ISA檢測模式，采用高特異性、高親合力的抗體，減少了操 作步驟，提高了檢測的靈敏度、準確度；采用包被抗原進行酶標板的包被，相對于抗體包被， 更有利于達到較好的包被效果與較長的保存時間，從而提高了試劑盒檢測的精密度與穩定 性；另外本試劑盒利用酶標板標記抗體技術，且采用改良后的過艦酸鹽氧化法進行標記，將 酶直接標記于黃曲霉毒素B1特異性抗體上，將黃曲霉毒素B1特異性抗體與酶兩種最重要 的反應物合二為一，提高了標記效率，節省了酶與抗體的用量，保證標記后酶與抗體具有良 好的活性，不僅大大簡化了操作步驟和反應時間，減少了因操作復雜引起的誤差，而且無需 在試劑盒內再配置抗抗體，同時也節約了黃曲霉毒素B1特異性抗體與酶的用量，從而大大 降低了試劑盒的成本。基于W上優點，本發明非常適用于黃曲霉毒素B1殘留的痕量分析與 批量檢測，具有重要的現實意義。
【附