用專用均相巧光免 疫分析儀器定量測定，巧光強度與樣品中CRP濃度成正比。
[0035] 本發明可同時檢測高值和低值CRP，尤其是低值CRP，且成本低廉，操作簡單、快 速、靈敏，且特異性好，只需要配套專用均相巧光免疫檢測儀，因此可廣泛應用于各級醫療 檢驗場所，尤其是基層醫療機構，包括鄉鎮衛生院等均可開展，對于屯、腦血管事件發生的預 防有極為重要的意義。
【附圖說明】
[0036] 圖1為本發明的一種實施例的作用原理圖，其中，1 ;Eu3+標記anti-CRP， 2 ;Alexa647 標記 anti-CRP，3 ;校準品或待測樣本中 CRP，4 ;Eu3+-anti-CRP-CRP- anti-CRP-Alexa647 免疫復合物；
[0037] 圖2為CRP濃度的標準曲線；
[003引圖3為CRP相關性分析曲線。
【具體實施方式】
[0039] 下面參照附圖，結合具體的實施例對本發明做進一步的說明，W更好地理解本發 明。其中，下述內容中若無特別規定物質濃度均為質量百分比濃度。
[0040] 實施例1
[0041] 1、標記用anti-CRP的準備；
[0042] 選用純化的基因工程表達的抗C-反應蛋白單克隆抗體。化標記用抗C-反應蛋 白單克隆抗體商品編號為12D8 ;巧光素標記用抗C-反應蛋白單克隆抗體商品編號為7D9 和 10C11。
[0043] 2、稀±元素馨合物標記anti-CRP的制備：
[0044] 用化0. 9%化C1于4°C透析鼠抗人CRP單抗12D8溶液（3mg/ml)兩次，每次2化r。 加水調濃度至1. 5mg/ml。取0. 6ml該抗體溶液，加入1ml Na肥〇3 (0. 2mol/L)，并用Imol/L 化OH調抑至9. 1。將20 y 1 B皿CT甲醇溶液（30 y g/mU滴加到攬拌下的抗體溶液中，并繼 續攬拌反應化r。離屯、（10000;rpm，lOmin)除去不溶物后，上Se地adexG-50柱，用0. 05mol/ L畑4肥化(P服.0)洗脫，分離標記蛋白質和游離的標記物。紫外/可見分光光度計檢測各收 集液的A33。值，合并含有標記抗體的溶液。加入終濃度為0. 1 %的BSA和0. 05 %的NaN 3,用 Imol/L肥1調抑至6. 2。分裝后-20°C儲存備用。用于免疫分析前，加入化CI3溶液炬皿CT 與化等摩爾濃度）。用于免疫分析時，用標記物稀釋液稀釋使用，2-8°C分裝保存。
[0045] 3、Alexa647標記抗體的制備；
[0046] 將抗CRP單克隆抗體7D9、10C11，分別用0. 1M碳酸氨鋼溶液稀釋至Img/ml，各取 5ml抗體溶液，分別加入30mg巧光素Alexa647溶解液，攬勻，室溫解育1小時，每隔15分鐘 混勻一次。最后用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的巧光素標記抗體，用含0. 01 % PEG、1 % BSA、5%甘油、0. 01 %表面活性劑的0. 01M磯酸鹽緩沖液稀釋，用塑料瓶密封包裝， 于4°C保存。
[0047] 4、系列濃度CRP校準品的制備；
[0048] 用含0. 05 %陽G、2. 5 % BSA、0. 025 %表面活性劑的0. 01M磯酸鹽緩沖液，按照 0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L的濃度稀釋溶解CRP純品，混勻后于4°C保存。
[0049] 實施例2
[0化0] 本實施例的制備方法與實施例1基本相同，不同點在于：
[0化^ 步驟2中，稀±元素馨合物標記anti-CRP的制備方法是：用化0. 9%化C1于4°C 透析鼠抗人CRP溶液（3mg/ml)兩次，每次2化r。加水調濃度至1. 5mg/ml。取0. 6ml該抗 體溶液，加入1ml Na肥03 (0. 2mol/L)，并用Imol/L化OH調抑至9. 1。將20 y 1 BHHBCB甲 醇溶液（30yg/ml)滴加到攬拌下的抗體溶液中，并繼續攬拌反應化r。離屯、（lOOOOrpm， lOmin)除去不溶物后，上Se地adexG-25柱，用0. 05mol/L畑4肥03 (P服.0)洗脫，分離標記 蛋白質和游離的標記物。紫外/可見分光光度計檢測各收集液的A33。值，合并含有標記抗 體的溶液。加入終濃度為0. 1 %的BSA和0. 05%的NaNs，用Imol/L肥1調抑至6. 2。分 裝后-20°C儲存備用。用于免疫分析前，加入化CI3溶液炬HHBCB與化等摩爾濃度）。用 于免疫分析時，用標記物稀釋液稀釋使用，2-8°C分裝保存。
[0化2] 實施例3
[0化3] 本實施例的制備方法與實施例1基本相同，不同點在于：
[0化4] 步驟3中，將抗CRP單克隆抗體7D9、10C11，分別用0. 1M碳酸氨鋼溶液稀釋至Img/ ml,各取5ml抗體溶液，分別加入40mg巧光素DyLi曲t-DY647溶解液，攬勻，室溫解育1. 5 小時，每隔15分鐘混勻一次。最后用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的巧光素標記 抗體，用含0. 025%陽G、2. 5% BSA、15%甘油、0. 03%表面活性劑的0. 01M磯酸鹽緩沖液稀 釋，用塑料瓶密封包裝，于4 °C保存。
[0化5] 實施例4
[0化6] 本實施例的制備方法與實施例1基本相同，不同點在于；
[0化7] 步驟3中，將抗CRP單克隆抗體7D9、10C11，分別用0. 1M碳酸氨鋼溶液稀釋至Img/ ml,各取5ml抗體溶液，分別加入50mg巧光素CF647溶解液，攬勻，室溫解育2小時，每隔 15分鐘混勻一次。最后用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的巧光素標記抗體，用含 0. 03%陽G、5 % BSA、10 %甘油、0. 05 %表面活性劑的0. 01M磯酸鹽緩沖液稀釋，用塑料瓶密 封包裝，于4°C保存。
[0化引實施例5
[0化9] 在臨床檢測中，實驗步驟為：先將50yl的稀±元素馨合物標記anti-CRP溶液 加入反應微孔中，再加入50 y 1的近紅外巧光化合物標記的anti-CRP溶液，最后分別加入 50 y 1的CRP校準品、臨床檢測樣品，37°C反應20分鐘后，用均相巧光免疫分析儀檢測判讀 結果。
[0060] 實施例6
[0061] 用專用的均相巧光免疫分析儀檢測巧光強度，各濃度校準品檢測結果如下：
[0062]
【主權項】
1. 一種快速定量檢測C-反應蛋白的均相熒光免疫試劑組，其特征在于，包括稀土元素 螯合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體、近紅外熒光化合物標記的抗C-反應蛋白單克隆 抗體和系列濃度的C-反應蛋白校準品。
2. 根據權利要求1所述的均相熒光免疫試劑組，其特征在于，稀土元素螯合物為Eu3+螯 合物。
3. 根據權利要求2所述的均相熒光免疫試劑組，其特征在于，稀土元素螯合物為 BHHCT-Eu3+或 BHHBCB-Eu 3+〇
4. 根據權利要求1所述的均相熒光免疫試劑組，其特征在于，所述近紅外熒光化合物 為Alexa系列近紅外熒光化合物、DyLight系列近紅外熒光化合物和CF系列近紅外熒光化 合物中的至少一種。
5. 根據權利要求4所述的均相熒光免疫試劑組，其特征在于，所述近紅外熒光化合物 Alexa647、DyLight-DY647 和 CF647 中的至少一種。
6. 根據權利要求1所述的均相熒光免疫試劑組，其特征在于，所述系列濃度的 C-反應蛋白校準品由校準品稀釋液稀釋C-反應蛋白配制而成，所述校準品稀釋液為含 0· 01-0. 5wt% PEG、l-5wt% BSA、0. 01-0. 05wt%表面活性劑的磷酸鹽緩沖液。
7. -種權利要求1-6中任意一項所述的均相熒光免疫試劑組的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟： 1) 稀土元素螯合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體的制備： 取0. 5-5mg/ml的抗C-反應蛋白單克隆抗體溶液，加入0. 05-0. 5mol/L的NaHCCV^ 液后，調pH至8. 5-10,滴加10-100 μ g/ml配體化合物溶液，攪拌反應0. 6-2h，分離得 到配體化合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體，加入終濃度為0. 05-0. 5wt %的BSA和 0. Ol-Iwt %的NaN3，調pH至5. 5-6. 5,免疫分析前，加入Eu3+溶液，使配體化合物與Eu 3+等 摩爾濃度，即得，其中，抗C-反應蛋白單克隆抗體溶液、NaHCO3溶液和配體化合物溶液的體 積比為 〇· 1-1 : 1 : 〇· 01-0. 05 ; 2) 近紅外熒光化合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體的制備： 將抗C-反應蛋白單克隆抗體用0. 05-0. 5mol/L的NaHCO3溶液稀釋至0. 5-5mg/ml，加 入近紅外熒光化合物溶解液，攪勻，室溫孵育0. 5-2h，分離得到近紅外熒光化合物標記的抗 C-反應蛋白單克隆抗體； 3) 系列濃度的C-反應蛋白校準品的制備： 將C-反應蛋白用校準品稀釋液稀釋配制成系列濃度，即得， 其中，1)、2)和3)的順序可以任意顛倒。
8. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，抗C-反應蛋白單克隆抗體在于配體 化合物反應之前，先進行透析處理。
【專利摘要】本發明提供了一種快速定量檢測C-反應蛋白的均相熒光免疫試劑組及其制備方法。本發明所述的快速定量檢測C-反應蛋白的均相熒光免疫試劑組，包括稀土元素螯合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體(anti-CRP)、近紅外熒光化合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體和系列濃度的C-反應蛋白校準品。本發明可同時檢測高值和低值CRP，尤其是低值CRP，且成本低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，只需要配套專用均相熒光免疫檢測儀，因此可廣泛應用于各級醫療檢驗場所，尤其是基層醫療機構，包括鄉鎮衛生院等均可開展，對于心腦血管事件發生的預防有極為重要的意義。
【IPC分類】G01N33-533, G01N33-577
【公開號】CN104569374
【申請號】CN201510003779
【發明人】謝愛武
【申請人】深圳市艾瑞生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月4日