一種鑒定生物組織中含糖醛酸多糖的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種檢測生物大分子的方法，更具體，設及鑒定生物組織中含糖醒酸 多糖的方法。
【背景技術】
[0002] 多糖及其綴合物，如糖蛋白、糖脂、糖胺聚糖等作為信息分子參與了各種生命現象 和生理過程，它們廣泛存在于生命體中。已有研究證實很多多糖具有種屬和臟器專一性，而 且生物體內的多糖不僅與遺傳因素有關，還與生物體的生理狀態有關。所W，對多糖的鑒定 能夠為生物樣品來源、生理狀態等提供信息。而且，多糖還是評價食品營養的重要指標，它 不僅能夠為人體提供能量，還可能具有重要的生理功能。
[0003] 對生物組織樣品中多糖的鑒定，通常需要經過繁瑣的分離純化后，再采用多種化 學和光譜學的方法進行結構解析。一些色譜手段，如電泳、凝膠過濾色譜等，能夠根據分子 量和電荷分離多糖，但難W準確鑒別出它們的種類。對降解產生的寡糖片段進行分析W確 定多糖種類是一條捷徑，但目前只有極少數有相應降解酶的多糖應用了該方法，例如肝素 和硫酸軟骨素，但降解酶和寡糖標準品價格都十分昂貴，難W廣泛應用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種鑒定生物組織中含糖醒酸多糖的方法，其中的含糖醒 酸多糖具體是指結構中包含由一個糖醒酸與一個氨基己糖或己糖組成的重復二糖片段的 多糖的檢測。本發明具有效率高的特點，可W對生物組織中的多糖直接進行檢測。
[0005] 為了達到上述目的，本發明提供一種鑒定生物組織中含糖醒酸多糖的方法，包括 如下步驟：
[0006] S1、提取生物組織中的粗多糖；
[0007] S2、所述粗多糖利用=氣己酸水解，所得水解物除酸；
[000引 S3、步驟S2所得殘余物，用1-苯基-3-甲基-5-化挫咐酬衍生化，制備糖的衍生 物；
[0009] S4、對已鑒定含有糖醒酸的多糖W步驟S2和S3的方法制備對照品溶液；
[0010] S5、W液相色譜-質譜技術分析提取步驟S3糖的衍生物和S4對照品溶液，通過比 對，實現鑒定生物組織中含糖醒酸多糖。
[0011] 其中，本發明方法用于鑒定生物組織中由一個糖醒酸與一個氨基己糖或己糖組成 的重復二糖片段的多糖。優選方式下，步驟S4中所述含糖醒酸的多糖為硫酸軟骨素、肝素、 透明質酸或鮑魚多糖。
[0012] 優選方式下，本發明方法的具體步驟為：
[0013] S1、取生物組織，勻漿后，用蛋白酶酶解；將酶解液離屯、，取上清液加入己醇醇沉， 收集沉淀，干燥，得粗多糖樣品；
[0014] S2、取粗多糖樣品10?200mg，l血1?2mol/L的S氣己酸100?120°C，水解1? 化；酸水解液加入ImL水，使用減壓除去溶劑，重復S次，達到除酸目的；
[0015] S3、加入200?2000 y L的氨水溶解殘渣，取出200?400 y L溶液加入到具塞試管 中，再向具塞試管中加入200?400 UL 0. 3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-化挫咐酬（PM巧甲 醇溶液，70°C水浴30min，加入3mL甲醇，使用旋轉蒸發儀減壓除去溶劑；然后加入ImL水， 再加入ImL的氯仿，震蕩后除去氯仿，重復萃取S次，水層作為鑒定液；
[0016] S4、所述含糖醒酸的多糖取樣量為0. 5?5mg，按照S2和S3進行酸水解和衍生化， 得對照品溶液；
[0017] S5、W己膳/20mM己酸錠水溶液為流動相，使用配備反相娃膠柱的液相色譜-質 譜；采用正離子模式，選擇含糖醒酸二糖的衍生物的準分子離子，色譜峰保留時間和質譜數 據與對照品比對，從而推斷生物樣品中含糖醒酸多糖的種類。
[0018] 上述優選方式下，最優情況為：
[0019] 步驟S2中S氣己酸濃度為1. 3mol/l，水解溫度105°C，水解時間為化。
[0020] 步驟S5中液相色譜-質譜技術選擇m/z 686. 26 + 0. 5，m/z 687. 25 + 0. 5的離子。 大部分情況下是m/z 686. 26 + 0. 5, m/z 687. 25 + 0. 5的離子，但也可能有其他離子。
[0021] 此外，步驟S1中，所用蛋白酶優選為膜蛋白酶和木瓜蛋白酶，其他類可行蛋白酶 也適用。
[0022] 本發明方法適用于結構中包含由一個糖醒酸與一個氨基己糖或己糖組成的重復 二糖片段的多糖的檢測。該種多糖在生物組織中存在廣泛，可W存在于動物、植物、微生物 組織中，而且具有多種生物活性。如糖胺聚糖中的肝素、硫酸軟骨素、透明質酸等，都是由糖 醒酸與氨基己糖連接而成的重復二糖片段構成。另外在一些貝類、海藻、細菌中發現了結構 中存在糖醒酸與己糖連接而成的重復二糖片段的多糖。
[0023] 酸水解法成本低，操作簡單，而且對各種多糖都有降解作用。本發明是根據糖醒 酸的糖巧鍵較難被酸水解該一特點，獲得二糖片段產物，供檢測分析，間接實現對含糖醒酸 多糖的鑒定。
[0024] 本發明可W對生物組織中的多糖直接進行檢測，避免了繁瑣的分離純化過程，使 用樣品量較少，可在較短時間內獲得結果。
【附圖說明】
[0025] 圖1是實施例1的不同TFA濃度得到的二糖PMP衍生物的峰面積
[0026] 圖2是實施例1的不同酸水解溫度得到的二糖PMP衍生物的峰面積
[0027] 圖3是實施例1的不同酸水解時間得到的二糖PMP衍生物的峰面積 [002引圖4是實施例2對照品的選擇離子色譜圖；
[0029] 圖5是實施例2樣品的選擇離子色譜圖。
[0030] 圖6是實施例3樣品的選擇離子色譜圖。
【具體實施方式】
[0031] 本發明一種生物組織中含有糖醒酸的多糖的快速分析方法，具體步驟如下：
[0032] Stepl、取生物樣品，勻漿后，用蛋白酶酶解；將酶解液離屯、，取上清液加入己醇醇 沉，收集沉淀，干燥，得粗多糖樣品；
[003引 St巧2、取粗多糖樣品10?200mg，1血1?2mol/L的S氣己酸100?12(TC，水 解1?化；酸水解液加入ImL水，使用減壓除去溶劑，重復S次，達到除酸目的；
[0034] St巧3、加入200?2000 y L的氨水溶解殘渣，取出200?400 y L溶液加入到具塞 試管中，再向具塞試管中加入200?400 UL 0. 3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-化挫咐酬 (PMP)甲醇溶液，70°C水浴30min，加入3血甲醇，使用旋轉蒸發儀減壓除去溶劑；然后加入 ImL水，再加入ImL的氯仿，震蕩后除去氯仿，重復萃取=次，水層作為供試液；
[0035] Step4、W硫酸軟骨素、肝素、透明質酸、鮑魚多糖等含糖醒酸的多糖為對照品，取 樣量為0. 5?5mg，按照Step2和Step3進行酸水解和衍生化，得對照品溶液；
[0036] Steps、液相色譜-質譜分析；W己膳/20mM己酸錠水溶液為流動相，使用反相娃膠 柱色譜；采用正離子模式，提取m/z 686. 26 + 0. 5, m/z 687. 25 + 0. 5的離子色譜峰，保留時 間和質譜數據與對照品比對