一種尿液中巰基尿酸類物質的分離富集及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種尿液中琉基尿酸類物質的分離富集和檢測方法，具體設及尿液 中7種琉基尿酸類物質的快速分離富集方法，W及一種采用高效液相色譜串聯質譜法 (HPLC-MS/M巧測定吸煙者尿液中7種琉基尿酸物質含量的分析方法。
【背景技術】
[0002] 卷煙燃燒會產生大量的揮發性有機化合物，其中就包括丙締醒、苯、1,3-了二締、 苯己締、己豆醒等，該些揮發性有機物具有較強的致癌或致突變作用，進入人體后會對人體 的代謝物產生影響，主要形成琉基尿酸類物質。該類物質具有較好的特異性，是外源性親電 子化合物與谷脫甘膚結合后的分解產物，不再進一步發生反應，可W作為煙氣暴露評定標 志物。
[0003] 已有研究表明上述揮發性有機化合物所形成的7種琉基尿酸類物質分別；S-苯琉 基尿酸（PMA)、N-己酷基-S- (2-哲基-1-苯己基）半脫氨酸（P肥MA)、己酷-S- (3-哲丙 基-1-甲基）A-2-氨基-3-琉基丙酸鹽二環己基胺（HPMMA)、N-己酷基-S- (4-哲基-2- 了 締-1-基）A-半脫氨酸（MHBMA)、N-己酷-S-(3-哲丙基）半脫氨酸二環己基（3HPMA)、 N-己酷-S-(2-駿己基）A-半脫氨酸二（二環己胺）（CEMA)和N-己酷-S-(3,4-二哲基了 基）A-半脫氨酸值HBMA)。由于該類物質含量較低，代謝物基質也較為復雜，因此分析吸煙 者尿液中的琉基尿酸類物質具有相當高的難度。
[0004] 目前，富集琉基尿酸類物質主要依靠固相萃取（SP巧完成，之后配合HPLC-MS/MS 分析檢測。但是采用SPE實現樣品富集，耗時長，成本高，且洗脫時有機溶劑使用量大，對環 境不友好。該些問題極大影響了富集琉基尿酸的能力，同時影響了分析琉基尿酸類物質結 果的準確性。
[0005] 離子液體是一種新型的綠色溶劑，是完全由離子組成的鹽類，在室溫呈液體狀態， 一般由含氮、磯的有機陽離子和無機陰離子組成。改變陰陽離子組成，可W組成不同性質 的離子液體。目前，與廣泛應用的有機溶劑相比，離子液體具有W下突出的優點；（1)蒸汽 壓極低，不易揮發；(2)對有機物、無機物都有良好的溶解性，可W作為良好的液體萃取劑； (3)具有結構可調控性；(4)離子液體有良好的導電性、熱穩定性和極好的抗氧化性。因此， 本發明利用離子液體的上述特性，在優化條件的基礎上實現琉基尿酸類物質的富集。選擇 高靈敏度的HPLC-MS/MS分析平臺，實現了吸煙者尿液中7種琉基尿酸物質快速準確分析。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于針對現有技術的缺陷，提供一種尿液中琉基尿酸類物質的分 離富集和檢測方法；利用與水相互不相容的離子液體（1-辛基-3-甲基咪挫六氣磯酸鹽， [Csmim]腫6])作為富集介質，通過在尿液中施加極少量的離子液體[Csmim]腫6]與己膳， 控制富集條件達到琉基尿酸類物質的富集。之后采用HPLC-MS/MS分析平臺，完成7種琉基 尿酸類物質即CEMA、DHBMA、MHBMA、PMA、HPMMA和P肥MA分析。
[0007] 具體，所述一種尿液中琉基尿酸類物質的分離富集方法，包括W下步驟：
[000引 （1)在吸煙者尿液中添加離子液體1-辛基-3-甲基咪挫六氣磯酸鹽（[Csmim]
[PFe])和己膳，混合形成混合乳液；
[0009] (2)離屯、分離即得到富集有琉基尿酸類物質的下層液體。
[0010] 本發明所述方法中尿液中琉基尿酸類物質富集原理在于：乳液一般是由水、油、 助劑等組分W適當比例自發形成的低粘度且各向同性的熱力學穩定體系。由于體系到達 平衡的時間很短，因此極大加快富集的時間。本發明在吸煙者尿液中添加離子液體1-辛 基-3-甲基咪挫六氣磯酸鹽（[Csmim] [PFe])和己膳后，能很快形成1-辛基-3-甲基咪挫六 氣磯酸鹽（離子液體）/己膳/尿液所組成的乳液混合體系，從而實現快速萃取琉基尿酸的 目的。
[0011] 優選的，步驟（1)中，所述離子液體1-辛基-3-甲基咪挫六氣磯酸鹽（[Csmim] [PFe])、己膳和吸煙者尿液的混合配比為；30?lOOmg ;0. 5?2mL ;2?10血。
[0012] 優選的，步驟（1)中，所述形成混合乳液過程為，先禍旋30-120秒，然后再于 20-50°C條件下超聲1-3分鐘。
[0013] 禍旋（Vortex)有時也稱旋禍。是指一種半徑很小的圓柱在靜止流體中旋轉引起 周圍流體作圓周運動的流動現象。實驗中禍旋的作用是將水相和離子液體相進行充分的物 質交互，W提高萃取效率，同時使體系形成乳液。整個過程必須是先禍旋后超聲。
[0014] 優選的，步驟（2)中，采用高速離屯、機，在3000-8000轉/分的轉速下，離屯、1-5分 鐘。
[0015] 優選的，所述琉基尿酸類物質包括；S-苯琉基尿酸（PMA)、N-己酷基-S-(2-哲 基-1-苯己基）半脫氨酸（P肥MA)、己酷-S- (3-哲丙基-1-甲基）A-2-氨基-3-琉基丙 酸鹽二環己基胺（HPMMA)、N-己酷基-S- (4-哲基-2- 了締-1-基）半脫氨酸（MHBMA)、 N-己酷-S-(3-哲丙基）半脫氨酸二環己基（3HPMA)、N-己酷-S-(2-駿己基）A-半脫氨 酸二（二環己胺）（CEMA)和N-己酷-S-(3,4-二哲基了基）A-半脫氨酸值HBMA)等。
[0016] 優選的，本發明進一步提供一種吸煙者尿液中7種琉基尿酸類物質的分析檢測方 法，具體包括W下步驟：
[0017] 訊配制五級標準工作溶液，每級標準工作溶液均為含有PMA、P肥MA、HPMMA、 MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA的甲醇溶液；配制內標溶液，所述內標溶液為含有Dg-PMA、 "Ce-P肥MA、町-HPMMA、De-MHBMA、D3-3HPMA、D3-CEMA 和 D7-D皿MA 的甲醇溶液；
[0018] (II)在每級標準工作溶液中加入相同的內標溶液，并加入1-辛基-3-甲基咪挫六 氣磯酸鹽與己膳形成混合乳液；然后離屯、分離獲得下層液體；采用液相色譜串聯質譜對下 層液體進行測定，獲得7種琉基尿酸類物質的標準色譜分離圖；
[0019] (III)取吸煙者尿液，加入內標溶液，并加入1-辛基-3-甲基咪挫六氣磯酸鹽與己 膳形成混合乳液；然后離屯、分離獲得下層液體；采用液相色譜串聯質譜對下層液體進行測 定，獲得吸煙者尿液中各琉基尿酸類物質的實際樣品色譜分離圖；
[0020] (IV)利用所制得標準色譜分離圖和實際樣品色譜分離圖進行定性和定量分析。
[0021] 其中，
[0022] 優選的，步驟（I )中，所述第一級至第五級標準工作溶液中PMA、PHEMA、HPMMA、 MHBMA、3HPMA、CEMA 和畑BMA 的濃度均分別為 lng/mL、5ng/血、lOng/mL、lOOng/血和 500ng/ mL。
[0023] 優選的，步驟（I )中，所述內標溶液中 D5-PMA、"Ce-PHEMA、D4-HPMMA、De-MHBMA、 D3-3HPMA、D3-CEMA 和 D7-DHBMA 的濃度均為 50ng/mL。
[0024] 優選的，步驟（II )中，每級標準溶液、內標溶液、1-辛基-3-甲基咪挫六氣磯酸鹽 和己膳的相對加入量為2?lOmL ;20?100 y L ;30?lOOmg ;0. 5?2血。
[0025] 優選的，步驟（II )中，所述形成混合乳液過程為，先禍旋30-120秒，然后再于 20-50°C條件下超聲1-3分鐘。
[0026] 優選的，步驟（II )中，所述離屯、分離采用高速離屯、機，在3000-8000轉/分的轉 速下，離屯、1-5分鐘。
[0027] 優選的，步驟（III)中，所述吸煙者尿液、內標溶液、1-辛基-3-甲基咪挫六氣磯酸 鹽和己膳的相對加入量為2?lOmL ;20?100 y L ;30?lOOmg ;0. 5?2血。
[002引優選的，步驟（III)中，所述形成混合乳液過程為，先禍旋30-120秒，然后再于 20-50°C條件下超聲1-3分鐘。
[0029] 優選的，步驟（III)中，所述離屯、分離采用高速離屯、機，在3000-8000轉/分的轉 速下，離屯、1-3分鐘。
[0030] 優選的，步驟（II )和（III)中，所述液相色譜串聯質譜測定時的色譜條件為；負離 子模式EI源；色譜柱為；150mmX2. 1mm i. d, 3 ym Sequant ZIC-地ILIC色譜柱；流動相A相 為0. 2wt%的己酸己膳溶液，流動相B相為0. 2wt%的己酸水溶液；梯度洗脫程序；0-2min 95%vA巧v%B;5min 90v%A+10v%B;