一種炎性腸病狀態下藥物敏感性的新檢測指標及其在藥物治療方案設計中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物代謝動力學、藥理學、細胞生物學、分子生物學等多個領域，創新性地揭示了炎性腸病的天然耐藥現象，發現了一種基于外周血單核細胞P-gp表達量的新檢測指標用于炎性腸病狀態下藥物敏感性的檢測，并闡明了相關機制，同時提出聯用P-gp抑制劑的藥物治療方案可能用于逆轉炎性腸病天然耐藥。
【背景技術】
[0002]炎性腸病(IBD)是一種慢性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(⑶)和潰瘍性結腸炎(UC)兩種。其不僅在美國及歐洲國家盛行，在我國的發病率也逐年升高。IBD的病因和發病機制尚未明確，可能與飲食習慣、環境因素、遺傳因素、微生物感染等多種因素相關。此外，由于IBD病人常伴有免疫紊亂的現象，其也被視為一種自身免疫性疾病。臨床治療時常使用免疫抑制劑或抗炎藥以減輕腸道炎癥反應，然而反復發病及藥物耐受現象的產生常常限制其最終臨床療效。
[0003]自身免疫性疾病治療過程中產生的藥物耐受可以分為天然耐藥和獲得性耐藥兩種，均與外周血單核細胞P-糖蛋白(P-gp)表達升高相關。天然耐藥是指病人在初次給藥時就出現藥物耐受現象。自身免疫性疾病發病過程中，過量的炎癥因子通過P-gp轉運至胞外產生異常炎癥反應，并反饋刺激P-gp表達進一步升高。由于多數免疫抑制劑是P-gp的底物，因此升高的P-gp能夠將免疫抑制劑外排出免疫細胞，導致自身免疫性疾病治療可能存在天然耐藥的現象。獲得性耐藥是指病人在多次給藥后逐漸出現對藥物敏感性下降的現象。大量研宄表明自身免疫性疾病病人長期使用免疫抑制劑后常出現嚴重的藥物耐受反應，即免疫抑制劑通過誘導外周血單核細胞P-gp表達，降低胞內藥物濃度，從而產生獲得性耐藥。為控制病程發展、減輕病理癥狀，IBD病人需服用包括糖皮質激素在內的多種免疫抑制劑，但臨床研宄證實長期用藥可導致外周血單核細胞P-gp上調最終造成藥物療效下降。盡管關于IBD治療過程中產生的獲得性耐藥已被證實，但IBD病人是否存在天然耐藥卻鮮有研宄。對天然耐藥的忽視可能導致臨床治療延誤及錯誤增加用藥劑量，加速獲得性耐藥的產生。因此，對IBD病人初次用藥前或多次用藥后的藥物敏感性進行科學評估非常必要和重要，評估結果有助于優化IBD的藥物治療方案，提高短期及長期免疫抑制劑用藥的最終療效。
【發明內容】
[0004]本發明旨在證實IBD天然耐藥現象的產生，并闡明這一現象發生的相關機制，即炎性腸病小鼠體內過度分泌的細胞因子TNF- a、IL17及LPS通過STAT3/Nf- κ b途徑，促進STAT3磷酸化，進而誘導P65磷酸化及核轉位促進外周血單核細胞P-gp表達，降低胞內免疫抑制劑的藥物濃度，抑制其治療效果，從而造成天然耐藥的產生。而給予P-gp特異性抑制劑可以逆轉這一耐藥現象。定量PCR及LC-MS/MS檢測結果表明炎性腸病小鼠體內外周血單核細胞mdrl表達升高、胞內藥物水平較正常小鼠偏低；ELISA檢測結果證實炎性腸病小鼠血漿中TNF-a、IL-|3、IL-6、IL-17、LPS分泌水平升高，且體外細胞實驗表明上述炎癥因子及LPS均可誘導mdrl表達升高；Western Blot實驗表明TNF- a，LPS及IL17是通過誘導Ρ65磷酸化及核轉位促進外周血單核細胞P-gp表達。通過炎癥刺激或轉染實驗模擬IBD病人體內外周血淋巴細胞的生理狀態，給予特異性P-gp抑制劑后可逆轉胞內藥物濃度下降的現象。
【附圖說明】
[0005]圖1、TNBS造模小鼠出現天然耐藥現象，外周血單核細胞P-gp表達量升高，外排作用增強，胞內環孢素CYSA累積水平降低。
[0006]圖2:TNBS造模小鼠血漿中炎癥因子(TNF-α，IL-β，IL-6，IL-17)及LPS水平顯著升高
[0007]圖3:炎癥因子(TNF-a，IL-β，IL_6，IL-17)及LPS可誘導人源性巨噬細胞THP_1及人源性淋巴細胞CCRF-CEM外排轉運體P-gp表達升高
[0008]圖4:IL-17可激活STAT3/Nf_ κ b途徑，LPS、TNF- a可激活P65磷酸化及核轉位
[0009]圖5:P-gp抑制劑可逆轉IBD天然耐藥現象。
【具體實施方式】
[0010]藥品與試劑
[0011]細胞培養:人源性巨噬細胞THP-1及人源性淋巴細胞CCRF-CEM購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collect1n，ATCC，Rockville, MD)，于 37°C，5% CO2條件下常規培養，培養基為RPMI 1640培養基，含10%小牛血清，以及青霉素62.5mg/L，鏈霉素100 mg/L，于組織培養曲頸瓶中培養，每隔2?3天離心換液。RPMI1640培養基購于GIBCO (Gland Island, New York)，小牛血清購于 Hyclone (Logan，Utah，USA)，細胞培養耗材購于 Costar (Cambridge, MA, USA)。
[0012]動物飼養:清潔級BALB/c小鼠，體重18_22g，周齡8_10周，由南京軍區南京總醫院實驗動物中心提供。適齡BALB/c小鼠在標準飼養條件下飼養，溫度:22-24°C，相對濕度:60%，光照、黑暗:12h/12h，自由飲食、飲水，適應一周后進行實驗。
[0013]PCR:小鼠mdrla及內參actin、人MDRl及內參ACTIN引物均購自Invitrogen (Gibco-1nvitrogen, USA) ；Trizol 總 RNA 提取試劑、RT-PCR 試劑盒、Real-timePCRMaster Mix (SYBR green)購于 Takara(大連寶生物，Japan)。
[0014]LC-MS/MS:甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)購自 Sigma-Aldrich (St.Louis，MO)。甲酸及其它分析純化學試劑均購于南京化學試劑廠(江蘇，中國)。超純水由Mill1-Qsystem(Millipore, Milford, MA, USA)制備。
[0015]Western:RIPA 裂解液、5X 上樣緩沖液、1.5 M Tris-HCl pH 8.8,1 M Tris-HClpH 6.8,10% SDS、一抗二抗去除液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術研宄所(江蘇，中國)。苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)購自南京生興生物技術有限公司(江蘇，中國)。Glycine (電泳級)、SDS(電泳級)、Tris base (電泳級)、過硫酸胺(ammonium persulfate，APS)均購自 Amerso (USA)。30% Acrylamide/BisSolut1n (29:1)、N，N，N'，Nr -四甲基乙二胺(N，N，Nr，Nr -tetramethyl ethylenediamine，TEMED)均購自 B1-Rad。增強型化學發光試劑盒(Enhanced Chemiluminescence,ECL)購自 Thermo Fisher Scientific (USA)。Stat3、P65、P-P65、Lamin B 單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗購自Cell Signaling Technology (Boston，USA)，GAPDH單克隆抗體購自 B1world Technology (MN, USA).。
[0016]具體實例一 TNBS造模小鼠出現天然耐藥現象，外周血單核細胞P-gp表達量升高，外排作用增強，胞內環孢素CYSA累積水平降低。
[0017]TNBS小鼠造模:造模前BALB/c小鼠在動物房飼養一周。禁食24小后，苯巴比妥麻醉小鼠，3.5F導管從肛門插入腸道深約5.5cm。造模組以100mg/kg的劑量給予溶于30%乙醇中的TNBS，對照組以同等給藥體積給予30%乙醇。之后將小鼠倒置3分鐘，于給藥后第3天或第7天眼眶取血于含肝素的無菌試管中并處死老鼠。
[0018]外周血淋巴細胞提取:外周血淋巴細胞基于梯度離心的原理通過LympholyteMammal 試劑盒(Cedarlane Laboratories Ltd,Hunby,Ontar1,Canada))提取。向抽取所得的靜脈血中加入等體積RPM1-1640培養基進行1:1稀釋、混勻后，沿管壁輕輕加至等體積分離液之上(密度:1.086