Her2高表達的循環腫瘤細胞的多肽-磁性納米顆粒及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種多肽，尤其涉及一種可以用于富集、 分離和檢測人類表皮生長因子受體2(HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2,HER2) 高表達的循環腫瘤細胞（CirculatingTumorCell，CTC)的多肽-磁性納米顆粒及其制備 方法和應用。
【背景技術】
[0002] 癌癥是威脅人類的重大疾病之一，侵襲與轉移是惡性腫瘤最顯著的 特征之一，腫瘤細胞自發或因診療操作從原發腫瘤脫落，發生上皮-間質轉化 (Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)，從而具有流動特性，進入外周血中，就形 成了循環腫瘤細胞（CTC)。因此在外周血中檢測到循環腫瘤細胞（CTC)預示著有可能 發生腫瘤轉移，另外，美國哈佛醫學院的最新研宄表明，原位腫瘤組織能夠吸引CTC細胞 再次浸潤到原發腫瘤上從而促進腫瘤的生長（可參考K.Pantel等人，Nat.Rev.Clin. Oncol. 2009, 6, 339-351 ;J.Kaiser等人，Science2010, 327, 1072-1074)，因此CTC的高效檢 測對于研宄腫瘤轉移機制有指導意義，而且可以對指導腫瘤治療、判斷治療效果、推斷預后 提供可靠參考，對監測腫瘤的轉移或復發都有非常重要的意義。
[0003] 自1869年澳大利亞醫生ThomasAshworth在顯微鏡下首次從一名男性腫瘤轉移 患者的血液里觀察到CTC以來，CTC的研宄引起了人們的廣泛關注。CTCs在血液中的含量 極少（約幾個CTCs/105?107個單個核細胞），人們對CTC的富集檢測方法進行了不斷的 探宄。這些方法可以分為兩類：機械法和免疫分離法（可參考P.Paterlini-Brechot&N. L.Benali,CancerLett. 2007, 253, 180-204)。前者是根據CTC與血液中的白細胞和紅細 胞的細胞直徑及細胞密度不同，通過過濾或密度梯度離心的方法實現的；后者則主要是利 用CTC表面的一些特異性標記物如：常見的上皮標記物細胞角蛋白（Cytokeratins，CKs)、 上皮細胞粘附分子（EpCAM)、腫瘤胚胎抗原（CarcinoEmbryonicAntigene，CEA)和人類表 皮生長因子受體 2(HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2，HER2)等，通過抗原抗 體特異性結合反應實現CTC與血液中其他細胞的分離（可參考H.Xu等人，Biomaterials 2011，32, 9758-9765 ;S.L.Stott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2010,107, 18392-18397 ; S.Nagrath等人，Nature2007,450, 1235-1239 ;A. _E.Saliba等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA2010,107, 14524-14529 ;X.Wang等人，CancerRes. 2011，71，1526-1532)。
[0004] 與機械分離方法相比，免疫分離方法靈敏度高，分離的特異性好。在這些免疫分 析中，EpCAM和CKs是CTC檢測的常用表面標志物。然而，由于抗體生產成本及生產技術 的限制，導致這種基于抗體檢測CTC的技術成本較高，如CellSearch檢測一個血樣需要約 600美元，因此尋找能與CTC特異性靶向結合的新型化合物有重要的意義。近年來，研宄 者們在利用多肽進行腫瘤細胞的識別，靶向腫瘤細胞表面方面展開了廣泛的研宄，人們已 經從天然及合成的多肽中篩選出大量能分別靶向不同腫瘤細胞不同作用位點的多肽化合 物（可參考M.Shadidi&M.Sioud，FASEBJ. 2003,17, 256-258 ;M.Shadidi&M.Sioud，Drug Resist.Updates2003,6, 363-371)。在本課題組的前期工作中，已針對EpCAM設計了一系 列多肽，從低于30條的多肽庫中，篩選出了靶向EpCAM的特異性識別多肽。以此特異性識別 多肽為探針，將其修飾到磁性納米顆粒表面，利用磁性富集技術成功實現血液體系中人乳 腺癌細胞（MCF-7和SK-BR-3細胞）的富集，且富集率與抗體一致（Bai，L. ;Du，Y. ;Peng，J.; Yang,Y.etal.J.Mater.Chem.B, 2014, 2, 4080 - 4088) 〇
[0005] 然而，也有研宄表明，因為CTC經歷了一系列的EMT轉化過程，CTC表面的上皮特 性的分子標志物（例如EpCAM和CK等）可能會發生丟失。所以這種基于常見特異性標志 物的CTC檢測方法會漏掉一些CTC亞型，造成CTC檢測的假陰性。除了這兩種常見的表面 標記物以外，HER2蛋白由于其在腫瘤分型上的特殊作用也成為了一種重要的標記物。研宄 發現乳腺癌（20?35% )和卵巢癌（8?11% )這兩大惡性腫瘤細胞高表達HER2蛋白，且 預后較差，嚴重影響患者的健康和生命。J1ER2蛋白是一種跨膜受體蛋白，表現酪氨酸激酶 活性，分子量為185kD，由原癌基因HER2編碼，是表皮生長因子受體（EGFRs)家族的成員之 〇
[0006] 因此，尋找一種HER2高表達的循環腫瘤細胞的多肽及其復合物用于富集、分離和 快速檢測循環腫瘤細胞是目前亟待解決的問題。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的之一是提供一種能夠特異性識別循環腫瘤細胞（CTC)的多肽片段 替代現有的抗-循環腫瘤細胞抗體，從而降低檢測成本；本發明的另一個目的是結合現有 的納米技術，將該特異性識別多肽與磁性納米顆粒偶聯，即提供一種多肽-磁性納米顆粒， 提高對血液中稀少循環腫瘤細胞（CTC)的檢測效率。本發明的又一個目的是提供該特異性 識別多肽-磁性納米顆粒在制備用于檢測腫瘤的轉移或復發腫瘤治療效果評價藥物或產 品方面的應用。
[0008] 為達到此發明目的，本發明采用如下技術方案：
[0009] 第一方面，本發明提供了一種用于特異性識別循環腫瘤細胞的多肽，所述多肽的 氨基酸序列選自SEQIDNO: 1-SEQIDNO: 18之一所示的氨基酸序列。
[0010] 優選地，所述多肽的氨基酸序列選自如下SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列。
[0011] GRQLFDNPDQALLDTANDG
[0012] 本發明所述的多肽可通過特異性結合細胞人表皮生長因子受體2(Human EpidermalGrowthFactorReceptor2,HER2)識別循環腫瘤細胞。
[0013] 第二方面，本發明還提供了一種用于特異性識別循環腫瘤細胞的多肽-磁性納米 顆粒，所述的多肽_磁性納米顆粒含有磁性納米顆粒和與其相偶聯的如本發明第一方面所 述的多肽。
[0014] 優選地，所述多肽和磁性納米顆粒的質量比為0.01:5?4:5,例如可以是0.01:5， 0? 05:5,1:5,1. 2:5,1. 5:5,1. 8:5, 2:5, 2. 2:5, 2. 5:5, 2. 8:5,3:5, 3. 2:5, 3. 5:5, 3. 8:5,4:5， 優選為1:5?3:5。
[0015] 優選地，所述的磁性納米顆粒為鏈親和素修飾的磁性納米顆粒。
[0016] 優選地，所述磁性納米顆粒的粒徑為150_250nm，例如可以是150nm、180nm、 200nm、220nm、250nm，優選為 200nm。
[0017] 第三方面，本發明還提供了一種如本發明第二方面所述的多肽-磁性納米顆粒的 制備方法，所述方法包括如下步驟：
[0018] (1)制備如本發明第一方面所述的用于特異性識別循環腫瘤細胞的多肽；
[0019] (2)將步驟（1)中的多肽制成生物素修飾的多肽溶液；
[0020] (3)將磁性納米顆粒溶于緩沖液中制成溶液；
[0021] (4)將步驟（2)中生物素修飾的多肽溶液與步驟（3)的磁性納米顆粒溶液混合后， 混勻，將所述的多肽偶聯到所述的磁性納米顆粒表面，即得。
[0022] 本發明中，步驟（3)還包括將磁性納米顆粒溶液通過超聲或渦旋的方法進行分散 的步驟。
[0023] 本發明中，所述的磁性納米顆粒為鏈親和素修飾的磁性納米顆粒。
[0024] 本發明中，步驟（4)所述生物素修飾的多肽溶液與磁性納米顆粒溶液以 0? 01:5-4:5 的質量比混合，例如可以是 0? 01:5,0? 05:5,1:5,1. 2:5,1. 5:5,1. 8:5, 2:5， 2. 2:5, 2. 5:5, 2. 8:5, 3:5, 3. 2:5, 3. 5:5, 3. 8:5,4:5,優選為 1:5 ?3:5。
[0025] 本發明中，步驟（4)所述生物素修飾的多肽溶液與磁性納米顆粒溶液在4-37°C混 合0. 5-2h;優選為于20-30°C混合10min-2h;進一步優選為于25-28°C混合30-40min。
[0026] 本發明中，步驟（4)所述生物素修飾的多肽溶液與磁性納米顆粒溶液于恒溫搖 床上混合；優選地，所述的混合于4°C的恒溫搖床上混合；優選地，所述恒溫搖床的轉速為 100_200rpm，優選為 150rpm。
[0027] 第四方面，本發明還提供了一種如本發明第一方面所述的多肽或如第二方面所述 的多肽-磁性納米顆粒在制備用于富集、分離或檢測循環腫瘤細胞的產品中的應用。
[0028] 優選地，所述產品為試劑盒或試劑。
[0029] 第五方面，本發明還提供了一種如本發明第一方面所述的多肽或如第二方面所述 的多肽-磁性納米顆粒在制備用于治療腫瘤轉移相關疾病的藥物中的應用。
[0030] 優選地，所述腫瘤轉移相關疾病為人類表皮生長因子受體2 (HER2)高表達相關的 腫瘤。
[0031] 更優選地，所述人類表皮生長因子受體2高表達相關的腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、 肺腺癌、腎細胞癌和前列腺癌。
[0032] 本發明設計了一系列多肽片段，通過篩選得到了本發明的具有特異性識別HER2 特異性的多肽片段；本發明利用生物素-鏈親和素的強相互作用，將生物素修飾的特異 性識別多肽與鏈親和素修飾的磁性納米顆粒偶聯，用熒光顯微鏡觀察了修飾FITC-多 肽-Biot